Mol. Psychiatry:与神经发育障碍相关的突触结合蛋白-1 的新发错义突变使神经递质释放不同步

2024-02-18 xiongjy MedSci原创 发表于上海

在一名患有发育迟缓和 ASD 症状的患者中发现 Syt1 (P401L) 高度保守位置的错义从头突变,证明了于对 Syt1 功能的显性负面影响,这种突变会导致神经发育障碍。

大脑中的信息处理依赖于突触中与突触前动作电位 (AP) 活动同步的快速神经传递。近年来,一些具有不同严重程度神经发育症状的患者被描述为SYT1基因的新发杂合错义突变。SYT1编码钙传感器突触结合蛋白-1(Syt1),属于突触结合蛋白家族,突触结合蛋白是一组膜结合蛋白,包含两个钙结合C2结构域 C2A 和 C2B,可触发动作电位诱导的同步神经递质释放,同时抑制异步和自发释放。

本文描述了一个出现发育迟缓并携带从头杂合突变 c.1202 C > T 的个体,导致错义变异 Pro401Leu。

Syt1型小鼠通过杂交杂合小鼠(C57BL/6背景)产生。使用小鼠模型制备了海马自体培养物和海马培养物。形态学参数来自树突状(MAP2)和突触标志物(Syt1和VGLUT)染色的自体或大量培养物的共聚焦图像,并使用自动图像分析程序SynD进行分析。在自体和大量培养物中进行全细胞电压钳记录,以测量诱发和自发的 mEPSC 释放。使用高渗蔗糖应用来估计易释放的池。当无法假设正态性时,使用 student 或 Welch's t 检验和 Mann-Whitney U 检验确定统计学显著性。

本文的研究对象是一名 5.5 岁的男孩,因不明原因的高大身材、自闭症特征和轻度发育迟缓入院。根据智力测试,他的总智商 (IQ) 估计为 64-81。而且有感觉处理和信息处理困难,儿童精神科医生确认了该患者有神经生物学发育障碍。在 Vineland 适应性行为量表 3 上,他在沟通和社会化领域的适应性行为被测量为中低技能水平,而在日常生活技能领域,他的适应性技能处于充分到高水平。

Pro401 残基在各种脊椎动物和无脊椎动物直系同源物以及人类旁系同源物突触结合蛋白-2 中是进化保守的(如下图所示)。在gnomAD数据库中,来自不同血统的健康个体的76 000多个基因组中未发现该位置的变异,表明Pro401Leu不是常见的变异型, Pro401 位于 C2B 域的底部。这表明 Pro401 可能是 Syt1 功能的重要残基,并且在该位置用亮氨酸取代可能具有致病作用。

图1

图1:从头错义突变Syt1 Pro401Leu树突长度和突触数量减少

为了研究患者Syt1突变Pro401Leu对神经元发育和突触传递的影响,作者使用含有F2A连接的GFP的慢病毒表达载体表达携带同源突变Pro400Leu的小鼠Syt1(Syt1P400L,简称Syt1PL)或野生型Syt1来表达携带同源突变 Pro400Leu的小鼠 Syt1或野生型 Syt1(Syt1WT)。免疫染色的结果显示,Syt1WT 和 Syt1PL 挽救的神经元中 Syt1 和 GFP 的表达相似,且比例相同。此外,Syt1 与突触前标记物 VGLUT1 高度共定位(如图 1所示),这在 Syt1PL 和 Syt1WT 中是相同的。这表明蛋白质的稳定性和突触靶向不受 PL 突变的影响。

为了评估PL突变对神经元形态的影响,分别使用MAP2染色和VGLUT1/Syt1染色观察树突和突触,并使用半自动图像分析工具SynD进行分析。与 Syt1++WT 挽救的神经元相比,表达 Syt1PL 会使每个神经元的树突总长度减少 30%,同时 VGLUT1/Syt1 突触点的数量也会减少,但对突触密度没有影响。在 Syt1++PL 和 Syt1WT 挽救的神经元中,VGLUT1/Syt1 突触点的大小相同。通过 Sholl 分析量化的树突分支也减少了。这些结果表明,Syt1PL会影响树突的生长或稳定性,但不会影响突触发生。(如图1所示)

图2

图 2:Syt1PL型使神经传递不同步

为了研究患者突变对 AP 触发的释放的影响,使用全细胞电压钳测量了用 Syt1PL 或 Syt1WT 挽救的自突触海马 Syt1 null 神经元的诱发突触后电流(EPSC)。与 Syt1WT 挽救的神经元相比,Syt1PL 挽救的神经元的 EPSCs 振幅大大降低。成对脉冲刺激显示,组间的释放概率没有差异。尽管振幅降低,但根据 EPSC 电荷测量的释放总量并无差异。这表明,在 Syt1PL 挽救的神经元中,释放的时间过程更慢、更长。然而,Syt1PL 和 Syt1WT 的上升时间(从刺激开始到 EPSC 峰值的时间)是相同的。(如图2所示)

为了量化 EPSC 的衰减时间过程,作者用双指数拟合法拟合了衰减阶段。虽然快速和慢速成分(τfast 和 τslow)的衰减时间常数没有区别,但与 Syt1WT 相比,Syt1PL 神经元 EPSC 中慢速成分的相对振幅要大得多。与 Syt1WT 相比,Syt1PL 挽救的神经元的异步释放对每个 EPSC 释放总量的贡献增加了两倍。综上所述,这些数据表明 PL 突变增加了诱发释放中的异步成分,而这在 Syt1WT 挽救的神经元中几乎不存在。

图3

图 3:Syt1PL型在存在内源性Syt1的情况下树突长度和突触数量减少

为了研究Syt1PL变体是否会在WT Syt1存在的情况下影响神经元形态学和突触功能,在野生型(WT)神经元中过表达了Syt1PL或Syt1WT。MAP2 和 VGLUT1 的免疫染色显示,与过表达 Syt1WT 相比,过表达 Syt1PL 会使树突长度减少 17%,突触数量也会相应减少。树突分支也同样减少,而突触大小和密度则不受影响。(如图3所示)

图4

图 4:Syt1PL型在存在内源性 Syt1 的情况下异步释放增加

EPSC 振幅、电荷和达峰时间没有差异。同样,EPSC 衰减阶段的快慢分量的时间常数也没有差异,但慢分量对 Syt1PL EPSC 总振幅的贡献更大,与 Syt1WT 相比,这与异步释放部分增加 61% 有关。在 20 Hz 频率期间,异步释放部分增加,刺激后尾电流衰减更慢。最后,两组在 40 Hz 列车期间释放的总电荷以及反推法估计的 RRP 没有差异。总之,这些结果表明 Syt1PL 对树突长度和异步释放的抑制具有显性负效应。(如图4所示)

图5

图 5:Syt1PL型突变会增加自发传播,超过自体培养和大规模培养的 Syt1-KO 水平

鉴于 Syt1PL 未能有效抑制异步释放,作者接下来研究了 Syt1PL 抑制自发微型释放的能力。对微型 EPSC(mEPSC)率的分析表明,与 Syt1WT 相比,用 Syt1PL 挽救的 Syt1 null 神经元的微型 EPSC(mEPSC)率高出 4 倍。此外,Syt1PL 神经元的 mEPSC 振幅也增大了。当在存在 TTX(1 μM)的大规模培养中测量时,观察到 mEPSC 频率有类似的增加。此外,与过表达 Syt1WT 相比,在 WT 背景下过表达 Syt1PL 会导致 mEPSC 释放率增加 3 倍,但 mEPSC 振幅没有差异。这些数据共同表明,Syt1PL 在抑制自发微型释放方面具有显性负效应。(如图5所示)

图6

图 6:Syt1PL型形态学表型与活性有关

作者还分析了在存在和不存在破伤风神经毒素(TeNT)的情况下用 Syt1PL 或 Syt1WT 挽救的 Syt1 null/Syt1 knockdown (KD) 神经元的形态学。在有 TeNT 的情况下,Syt1PL 或 Syt1WT 表达神经元之间树突长度和突触数量的差异被消除,而突触密度在所有条件下都保持不变(如图6所示)。

总的来说,本文通过在一名患有发育迟缓和 ASD 症状的患者中发现 Syt1 (P401L) 高度保守位置的错义从头突变,证明了于对 Syt1 功能的显性负面影响,这种突变会导致神经发育障碍。

 

文献出处:

van Boven, M.A., Mestroni, M., Zwijnenburg, P.J.G. et al. A de novo missense mutation in synaptotagmin-1 associated with neurodevelopmental disorder desynchronizes neurotransmitter release. Mol Psychiatry (2024). https://doi.org/10.1038/s41380-024-02444-5

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