J Neuroinflammation：弹性反应增强子结合蛋白通过上调Lipocalin-2促进糖尿病神经炎症和认知损害

背景：2型糖尿病(T2DM)伴有慢性低度炎症，再加上高血糖，会并发严重的心血管和神经退行性疾病。脂肪组织中的脂肪细胞因子是肥胖和2型糖尿病炎症的重要来源。这些活性介质和促炎细胞因子导致胰岛素抵抗、氧化应激、神经炎症和记忆缺陷。糖尿病患者的海马体很容易受到活性介质肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6通过血脑屏障的破坏而受到影响。这些证据表明，在慢性糖尿病条件下，脂肪细胞因子的增加可能与糖尿病脑内其他炎症介质的功能相关，但导致糖尿病脑病的潜在分子机制尚不清楚。既往研究表明弹性反应增强子结合蛋白(TonEBP)促进糖尿病神经炎症。然而，TONEBP在糖尿病大脑中的确切作用还不完全清楚。

方法：TonEBP杂合子小鼠由蔚山国立科学技术研究所博士提供。将TonEBP(+/−)小鼠与C57BL/6J(韩国首尔中央实验动物公司)杂交，产生TonEBP(+/−)小鼠及其产仔。特别是，由于TonEBP纯合子缺失导致肾髓质显著萎缩，我们使用TonEBP(+/−)小鼠来研究TonEBP在这项糖尿病研究中的作用。所有实验都是根据美国国立卫生研究院关于使用实验动物的指南进行的。庆生国立大学(GNU)大学动物保护委员会批准了该研究方案(GNU160530-M0025)。雄性小鼠被单独安置在一个12h光/暗周期交替的环境中。糖尿病小鼠模型中采用高脂饮食(HFD)喂养的小鼠或高脂饮食/链脲佐菌素(STZ)治疗的小鼠。测定2型糖尿病受试者循环TONEBP和Lcn2水平。用TONEBP单倍体缺陷小鼠研究TONEBP在HFD/STZ诱导的糖尿病小鼠中的作用。另外，对RAW 264.7巨噬细胞进行脂多糖/高糖处理。利用siRNA，我们检测了TONEBP基因敲除对RAW264细胞培养基/汞处理的小鼠海马HT22细胞的影响。

结果：实验糖尿病小鼠或伴有认知障碍的2型糖尿病患者循环中TONEBP和Lcn2水平较高。TONEBP单倍体功能不全可改善糖尿病的表型，包括脂肪组织巨噬细胞浸润、神经炎症、血脑屏障渗漏和记忆障碍。TONEBP单倍体缺陷使糖尿病小鼠全身和海马Lcn2蛋白减少。与糖尿病野生型小鼠相比，TONEBP(+/−)小鼠海马血红素加氧酶-1(HO-1)表达降低。特别是，我们发现TONEBP与糖尿病海马中的Lcn2启动子结合，这种结合因TONEBP单倍性不足而减少。此外，TONEBP基因敲除降低了脂多糖/高糖处理的小鼠海马HT22细胞中Lcn2的表达。

图1 全身性炎症和神经炎症与HFD或HFD/STZ诱导的具有记忆缺陷的糖尿病小鼠有关。用定量RTPCR方法检测脂肪组织中肿瘤坏死因子-α(F=14.85，p<0.001)、白细胞介素-1β(F=12.71，p<0.001)、精氨酸(F=4.039，p=0.037)和mrc2mRNA(F=66.75，p<0.001)的表达(n=6~8)。C脂肪组织切片中Perilipin 1和CD68的代表性免疫荧光染色。在含或不含链脲佐菌素(STZ)的高脂饲料喂养小鼠(n=3-4)中，CD68阳性的巨噬细胞排列在坏死的无脂脂肪细胞周围的冠状结构(CLSS)中。3D代表性图像显示脂肪组织中的CLSS。巨噬细胞特异性F4/80、中性粒细胞特异性Ly6G和NE的免疫组化染色呈棕色。所有切片均用苏木精反染(n=3~4)。E-h Western blotting和定量海马RAGE(F=14.78，p=0.002)、核NF-κBp65f(F=5.173，p=0.036)、HO-1g(F=4.304，p=0.042)和VCAM-1h(F=7.729，p=0.009)。为了使总蛋白和核蛋白水平正常化，分别使用了β-肌动蛋白和P84。数据(n=3-5)用均值±扫描电镜表示。I海马CA1区IV型胶原(血管标记物)和GFAP(星形胶质细胞标记物)的代表性免疫荧光染色(n=3~4)。J-n逃避潜伏期j(F=3.261，p=0.045)，游泳速度k(F=0.72p=0.691)，游泳距离l(F=1.104，p=0.359)，在目标平台象限m(n=7，F=10.76，p<0.001)的时间，n条有代表性的游泳路径。圆框表示隐藏平台的位置。显示的p值代表单方差分析，然后是Tukey的特别后检验。*p<0.05，与ND相比。†与HFD比较P<0.0 5

图2 Lcn2和TONEBP在实验性糖尿病小鼠和糖尿病患者中显著升高。用ELISA法(n=8~11)测定血清Lcn2A(F=21.43，P<0.001)和TONEBP b(F=28.9，P<0.001)水平。血清Lcn2与TONEBP水平的相关性(n=7~11)。脂肪组织中Lcn2(F=9.924，p<0.001)和TONEBP(F=25.6p<0.001)mRNA的表达(n=6~8)。脂肪组织切片中具有代表性的TONEBP和Lcn2免疫荧光染色(n=3~4)。F Western blotting和LCN2在海马的定量表达(n=5~8，F=11.21，p<0.001)。条带强度归一化为β-肌动蛋白。G，h Western印迹和海马总TONEBP(n=3-5，F=6.234，p=0.023)和核TONEBP(n=4-5，F=5.566，p=0.024)的定量表达。为了使总蛋白和核蛋白水平正常化，分别使用β-肌动蛋白和P84。用ELISA法测定了对照组、糖尿病组和糖尿病合并轻度认知损害组(n=27~29)的循环Lcn21 i(F=3.391，p=0.039)和TONEBP j(F=4.527，p=0.014)水平。血清Lcn2与韩国简易精神状态检查(K-MMSE)评分的相关性(n=12~13)。数据显示为平均值±SEM。*p<0.05与CTL相比。显示的p值代表单方差分析，然后是Tukey的特别后检验。*p<0.05，与ND相比。†与HFD比较P<0.0 5

图3 TONEBP单倍体缺陷减轻HFD/STZ诱导的糖尿病小鼠的全身炎症和记忆缺陷。定量RTPCR检测脂肪组织中编码肿瘤坏死因子-α(F=10.11，p=0.005)、IL-1β(F=4.594，p=0.047)、Arg1(F=0.7228，p=0.406)和mrc2(F=7.333，p=0.014)的mRNA的表达(n=4~6)。用ELISAs(n=5~6)测定循环TONEBP c(F=4.3p=0.053)和Lcn2d(F=18.12p<0.001)水平。E Western blotting和定量脂肪组织表达TONEBP(F=35.91，p<0.001)和Lcn2(F=10.07，p=0.009)(n=3~4)。F代表H&E和TONEBP、Lcn2免疫染色图像(n=3~4)。图像中TONEBP(F=4.522，p=0.046)或LCN2(F=57.99p<0.001)阳性细胞计数(n=3~4)。数据显示为平均值±SEM。所示的p值代表双因素方差分析，然后是Tukey的特殊后检验。*p<0.05与WT ND相比。†p<0.0 5与WT HFD/STZ相比

图4 TonEBP在糖尿病诱导的神经炎症和记忆缺陷中作用的图示总结。在慢性糖尿病患者中，全身性炎症导致中性粒细胞通过血脑屏障渗漏。慢性糖尿病中LCN2的产生促进TonEBP介导的神经炎症，最终导致记忆缺陷。特别是，TonEBP在糖尿病条件下转录调控LCN2蛋白水平

结论：TONEBP可能通过上调Lcn2促进糖尿病小鼠的神经炎症和认知功能障碍。

原文出处：

Jeong EA,  Lee J,  Shin HJ,et al.Tonicity-responsive enhancer-binding protein promotes diabetic neuroinflammation and cognitive impairment via upregulation of lipocalin-2.J Neuroinflammation 2021 Nov 29;18(1)