Hypertension 福建医科大学林默君教授团队揭示肺动脉高压引发冠状动脉血清素高反应性和代谢重编程的机制

肺动脉高压(PH)是一种致命的血管疾病，其特征是肺动脉压力过高，伴有异常的血管反应和重塑。PH不仅在肺循环中引起病理变化，还在冠状血管系统中引起改变。研究发现，动脉型肺动脉高压(PAH)导致冠状动脉疾病(CAD)的发病率比一般人群高出4倍以上，并且增加右心室心肌梗死的风险。此外，已有研究报道，PAH还会引起冠状动脉(CA)血流受损，冠状动脉平滑肌细胞(CASMC)增殖和血管舒张功能异常。然而，PH和CA功能障碍之间的分子机制尚不清楚。血清素(又称5-羟色胺，5-HT)、活性氧(ROS)和Ca²⁺信号传导与PH和CAD有关。最近研究表明，NADPH氧化酶(NOX)和瞬时受体电位阳离子通道亚家族M成员2 (TRPM2)是它们三者之间相互作用的关键介质。由于Ca²⁺是线粒体代谢和功能的重要调节因子，因此探讨NOX-TRPM2信号通路是否参与PH中CASMC线粒体功能障碍相关的代谢重编程具有重要意义。

2024年1月4日，福建医科大学林默君教授团队在Hypertension上发表了题为“Pulmonary Hypertension Induces Serotonin Hyperreactivity and Metabolic Reprogramming in Coronary Arteries via NOX1/4-TRPM2 Signaling Pathway”的研究论文，揭示了PH 通过 NOX1/4-TRPM2引发右侧CA中5-HT反应性增加以及CASMC中代谢重编程和线粒体功能障碍的发生。该信号通路可能在PH的CA重塑和CAD中发挥重要作用。

首先，为了研究PH对CA重塑的影响，研究者建立了两种不同PH大鼠模型，一种由缺氧(CH)诱导，另一种由野百合碱(MCT)诱导。结果显示，与正常对照组(CON组)相比，PH大鼠的右心室收缩压、右心室质量指数和肺动脉中膜厚度显著增加。然而，PH组和CON组间的平均全身动脉压和左心室质量指数没有差异，表明PH主要影响肺循环和右心，而不影响体循环和左心室。在两种PH模型的CA形态学观察中，右侧和左侧CA (RCA和LCA)的血壁厚度均显著增加，而MCT组小血管的中层厚度似乎比CH组更大。RCA和LCA间没有差异。总结以上结果，可以得出PH促进CA血管重塑的结论。由于在PH病理条件下，LCA和RCA分支可能存在功能异质性，因此进一步对比了RCA和LCA的血管收缩反应功能。结果显示，5-HT诱导的RCA收缩在PH组明显更强，LCA中则没有观察到这一差异；CON组中内皮的完整性可抑制RCA对5-HT反应性，但在PH组中内皮完整性对5-HT引起的RCA收缩反应没有显著贡献。另外，5-HT预收缩无内皮RCA对硝普钠的内皮依赖性松弛没有改变。这些结果表明，PH促进了5-HT介导的RCA收缩反应性。

图1. PH模型CA重塑和对5-HT高反应性

NOX衍生的ROS和Ca²⁺信号通路在调节血管的收缩性和增殖中起着重要作用，而TRPM2是一种ROS敏感的Ca²⁺通道。因此，研究者进一步明确CH-CASMC和CH-RCA中NOX亚型和TRPM2的表达情况。结果显示，在CH-PH大鼠的CASMC中，NOX1、NOX4和TRPM2的mRNA和蛋白表达显著增加，而NOX2的表达保持不变。此外，在心脏切片的免疫荧光分析中，CH-RCA平滑肌层中NOX1、NOX4和TRPM2的蛋白表达也显著增加，表明在CH-PH的RCA中上调了NOX1/4-TRPM2信号通路。

为了确定NOX1/NOX4和TRPM2的功能作用，研究者使用ML171 (NOX1抑制剂)、GKT137831 (NOX1/4抑制剂)、过氧化氢酶(CAT, H₂O₂清除剂)或N-对戊基肉桂酰基-邻氨基苯甲酸(ACA, TRPM2拮抗剂)对RCA血管环进行预处理。与对照相比，CH大鼠RCA中的NOX/ROS/TRPM2抑制剂均能显著阻断5-HT的反应并呈现浓度依赖性。研究者又使用特异性siRNA敲低TRPM2，与ACA结果一致，siTRPM2有效抑制5-HT诱导的RCA收缩。siRNA对照和siTRPM2不影响KCl诱导的收缩。这些发现支持RCA中5-HT介导的高反应性依赖于NOX1/NOX4-ROS-TRPM2信号通路。

图2. NOX1/4-TRPM2通路介导5-HT诱导PH-CA收缩增强

为了测试NOX1/4衍生的ROS是否能够激活TRPM2并促进CASMC中的Ca²⁺内流，研究者使用微血管收缩和荧光信号同步检测系统来测定RCA血管环中的ROS和Ca²⁺信号。结果显示，5-HT刺激下正常组RCA血管环的张力-ROS或张力-Ca²⁺信号同步增加，CH组中反应进一步增强。5-HT激活的ROS增加可以被ML171、GKT或CAT抑制，在CH-CASMC中可以被siNOX1、siNOX4或CAT抑制，这表明NOX1/4介导了5-HT诱导的ROS增加。5-HT诱导的Ca²⁺瞬变可以被ML171、GKT、CAT、ACA或siTRPM2抑制。在CH-RCA中，静息状态下的[Ca²⁺]_i升高和5-HT诱导的Ca²⁺瞬变可以被siNOX1、siNOX4、siTRPM2或CAT抑制，这表明NOX1/4-TRPM2介导了5-HT诱导的钙信号增强。此外，两种模型的RCA中H₂O₂介导的收缩明显增强，TRPM2激动剂ADPR在模型组中收缩也明显增强，值得注意的是，敲低TRPM2后，H₂O₂和ADPR诱导的CH-CASMC中的Ca²⁺内流增加得到缓解。这些结果进一步证实了PH-RCA中TRPM2依赖性反应的增强。

图3. NOX1/4-TRPM2通路介导5-HT诱导PH-CA中ROS和Ca²⁺信号增强

随后，研究者进一步明确模型下CASMC中细胞功能的变化。相较于CON大鼠，CH大鼠CASMC增殖、迁移和凋亡水平明显增加，通过使用siNOX1、siNOX4、siNOX1+siNOX4或siTRPM2，以上效应能得到显著逆转。并且同时靶向NOX1和NOX4可进一步减轻细胞的增殖、迁移和凋亡，表明二者可能有协同促进作用。这些结果证实，NOX1/4-TRPM2介导了CH模型组中CASMC的增殖、迁移和凋亡的增加。

图4. NOX1/4-TRPM2通路介导CH-CASNCs增殖、迁移和凋亡

心血管疾病中SMC通过改变代谢方式以适应细胞表型改变。细胞的过度增殖和迁移对于核苷酸、脂质和蛋白质的合成具有更高的代谢需求(葡萄糖、ATP和NAD⁺)，本部分进一步探究NOX1/4-TRPM2信号通路对细胞能量代谢的影响。研究者发现CH-CASMC中细胞总葡萄糖摄取、ATP产生和乳酸产生显著增强，而线粒体基础耗氧率、ATP产量、线粒体最大呼吸和备用呼吸能力显著下降。研究提示，PH中CASMCs代谢方式从线粒体氧化磷酸化转变为糖酵解。同时siNOX1、siNOX4、siNOX1+siNOX4或siTRPM2能部分恢复这些变化，进一步表明CH-CASMC代谢重编程至少部分依赖于NOX1/4-TRPM2信号通路。

图5. NOX1/4-TRPM2通路介导CH-CASMCs的代谢重编程

代谢重编程与线粒体功能障碍密切相关。研究者随后探究了CASMC中NOX1/4-TRPM2信号轴对线粒体ROS产生、线粒体膜电位(MMP)、线粒体DNA (mtDNA)拷贝数、线粒体Ca²⁺和线粒体动力学的影响。在CH-CASMC中观察到线粒体ROS产生增加、MMP水平升高、mtDNA拷贝数减少和线粒体Ca²⁺超载，还观察到线粒体形态因子和纵横比的降低，提示存在线粒体断裂。通过siRNA敲低NOX1、NOX4和TRPM2部分逆转了这些变化，表明NOX1/4-TRPM2参与了线粒体功能的调节。

图6. NOX1/4-TRPM2通路介导CH-CASNCs的线粒体功能失调

最后，研究者通过在气管内滴注含有针对NOX1/NOX4的shRNA的腺相关病毒血清型颗粒(AAV)来探究NOX1/4敲低对CH-PH大鼠CA重塑的影响。免疫荧光检测显示心脏组织中AAV9-EGFP或AAV9-mCherry的表达，表明在体内感染成功。与对照组相比，NOX1或NOX4敲低明显降低了CH-PH大鼠右心室收缩压、右心室质量指数以及RCA和LCA中膜厚度的增加。

图7. 敲减NOX1/4 减轻PH诱导的CA重塑

综上，本研究揭示了NOX1/4-TRPM2信号通路通过调控ROS、Ca²⁺信号和线粒体功能的相互作用来加速PH中RCA对5-HT反应性和CASMC的代谢重编程；阐明了连接PH和CAD的分子信号通路(NOX1/4-TRPM2)；并提出针对这一途径预防心脏事件可能会使PH患者受益。本研究为PH对CAD的影响提供了证据，也为预防PH患者CAD的发展提供了理论依据。

本研究与约翰霍普金斯大学医学院James S.K. Sham教授合作完成，福建医科大学2019级博士研究生黄燕珍及中国科学院北京生命科学研究院博士研究生吴继春为本文共同第一作者，福建医科大学林达岑副教授和林默君教授为本文的共同通讯作者。

原文链接：

https://www.ahajournals.org/doi/10.1161/HYPERTENSIONAHA.123.21345