卵巢癌术后ctDNA动态监测有助于预测预后和及早识别复发

循环肿瘤DNA（ctDNA）可能有助于个体化卵巢癌治疗选择。本研究旨在评估使用tumor-naïve NGS小panel进行连续 ctDNA 检测的临床效用。共纳入296例患者，包括201例卵巢癌患者和95例良性或交界性疾病患者。在基线（初始诊断或手术）及之后每 3 个月收集样本，共 811 个血液样本。患者基于当前治疗标准接受辅助治疗。提取游离 DNA，使用包括 9 个基因（TP53、BRCA1、BRCA2、ARID1A、CCNE1、KRAS、MYC、PIK3CA 和 PTEN）的 NGS panel测序。69.2%（139/201）的卵巢癌患者基线检出致病性体细胞突变，而良性或交界性疾病患者未检出。基线和/或 6 个月时ctDNA检测可预测无进展生存期（PFS）。基线检出致病性突变且随访时持续检出的患者的PFS显著短于基线检出ctDNA但随访时未检出的患者；基线或随访样本未检出致病性ctDNA突变的患者与ctDNA从阳性转为阴性的患者的生存没有差异。与常规影像学评估或CA125监测相比，ctDNA更早地识别疾病复发。这些发现表明，连续ctDNA检测可以有效地监测患者及检测微小残留病灶，有助于及早发现疾病进展和制定个体化卵巢癌辅助治疗方案。

研究背景

卵巢癌是一种难治的恶性肿瘤，晚期患者的复发率为 70-80%，早期患者的复发率为 20-25%。初始肿瘤细胞减灭术（PDS）或间歇性肿瘤细胞减灭术（IDS），随后铂类辅助化疗，是卵巢癌的标准治疗。获批的维持治疗方案包括贝伐珠单抗（一种血管内皮生长因子抑制剂）和聚 ADP-核糖聚合酶（PARP）抑制剂。根据目前的指南，卵巢癌的治疗基于临床分期、乳腺癌基因（BRCA）状态或同源重组缺陷（HRD）状态。然而，进一步细化临床风险组和早期发现疾病进展对于改善卵巢癌的治疗结果是必要的。目前用于卵巢癌检测、预后分层和疾病监测的工具存在一些局限性。例如，CA125（初始诊断时最广泛使用的肿瘤标志物）的灵敏度和特异性较差，尤其是在早期癌症或高级别浆液性癌（HGSC）或子宫内膜样癌以外的组织学亚型患者中。CA-125 用于疾病监测灵敏度不是最佳，多达 50% 的 CA-125 水平正常的患者在二次手术中存在少量持续性疾病。此外，影像学方法成本高昂，患者暴露于辐射，且分辨率有限，因此在小体积肿瘤或低代谢疾病的情况下检出率有限。最近的一项研究表明，治疗前后肿瘤活检样本的程序性死亡配体 1（PD-L1）表达和肿瘤浸润淋巴细胞动力学与预后有关。但是，由于样本采集的风险，无法定期进行采样。

一种新开发的方法是实体瘤液体活检，基于循环肿瘤 DNA（ctDNA）二代测序（NGS）。ctDNA 的优点是具有高灵敏度（即使在早期癌症中）和高肿瘤特异性。在结直肠癌和肺癌中，探索了各种 ctDNA 应用，如微小残留病（MRD）评估和疾病进展早期检测。先前的泛癌研究探索了 ctDNA 在卵巢癌中的诊断价值。然而，关于卵巢癌使用连续收集的ctDNA进行预后分层和疾病监测的研究有限。此外，这些研究在特定情况下进行（如BRCA回复突变）或者纳入的患者数量有限。

总体而言，ctDNA检测在卵巢癌中的潜在用途尚未得到充分证明。欧洲肿瘤内科学会（ESMO）推荐在没有胚系致病性 BRCA 1/2 变异的患者中，或仅在组织不可及时使用 ctDNA。更多细节，如随访ctDNA采样的最佳时机和相较传统方法的监测能力，仍然未知。此外，在卵巢癌维持治疗时代，只有少数研究评估了连续ctDNA检测能否指导疾病管理。因此，我们从大队列卵巢癌患者中前瞻性地收集了 ctDNA，进行tumor-naïve小panel测序（包括TP53、BRCA1、BRCA2、ARID1A、CCNE1、KRAS、MYC、PIK3CA 和 PTEN），探索治疗前后 ctDNA 的动态变化及其在疾病监测中的价值。 

研究结果

2019 年 10 月至 2022 年 3 月期间，前瞻性招募韩国首尔延世癌症中心接受新诊断疾病PDS或IDS、诊断性腹腔镜检查或复发性疾病二次肿瘤细胞减灭术的卵巢癌患者（NCT 05504174）。非癌症对照组纳入了CA-125 > 35 U/mL、接受可疑卵巢肿块手术的患者。卵巢癌患者基于当前治疗标准接受辅助治疗，临床医生对ctDNA结果不知情。患者在初始诊断或手术时，以及随后每3个月采集全血样本用于ctDNA分析（图1A）。同时，每 3 周进行一次 CA-125 常规监测，每 3 个月进行一次腹部盆腔计算机断层扫描（APCT）。

图1

患者和人口统计特征

识别了 328 例具有疑似卵巢恶性肿瘤或良性至交界性卵巢肿块且 CA-125 水平升高（>35 U/mL）的患者。在排除诊断为同时性癌（n = 6）和样本质量不合格（n = 26）的患者后，对296例患者进行了分析，包括201例卵巢癌患者和95例良性或交界性卵巢肿块患者。ctDNA采样方案和患者选择流程如图1B所示。大多数患者处于晚期（76.6%，154/201），组织学亚型为高级别浆液性癌（74.1%，149/201），接受了PDS或新辅助化疗+ IDS（80.6%，162/201）。在24.9%（50/201）的卵巢癌患者中发现了胚系BRCA突变。中位随访时间为12.7个月（范围：1.6-33.1个月）。在随访期间，收集了 811 个样本，每例患者收集了中位 4 个样本（范围：1-8）。

基线ctDNA分析

在 201 例卵巢癌患者中，149 例为 HGSC。基线样本分析显示，74.5%（111/149）的 HGSC 患者和 53.8%（28/52）的非 HGSC 患者存在致病性体细胞突变。总体而言，69.2%（139/201）的卵巢癌患者存在致病性体细胞突变，而在 95 例良性或交界性疾病患者中未发现突变。最常见的突变是TP53（55.7%，112/201）、BRCA2（8.0%，16/201）、ARID1A（7.5%，15/201）、BRCA1（4.0%，8/201）、PIK3CA（5.0%，10/201）、KRAS（2.5%，5/201）和PTEN（2.5%，5/201）突变。基于组织学亚型分层的致病性体细胞突变的总体情况如图 2A 所示。此外，发现了与组织学亚型相关的特定突变：TP53突变与HGSC，ARID1A和PIK3CA突变与透明细胞癌，以及PTEN和KRAS突变与子宫内膜样癌。HGSC患者致病性TP53突变的检出率为67.1%（100/149）。TP53中最常见的突变为R273H、R248Q、R273C、R175H、R248W和Y220C，与COSMIC 浆液性癌数据库中列出的突变一致（图2B）。 

图2

在具有组织 NGS 数据的患者（n = 79）中比较 ctDNA 与组织 NGS 结果，在 88.6%（70/79）的患者中检测到致病性 SNV，两种方法的总体一致性为 91.1%（图 2C）。与FFPE样本TSO500 panel（包括532个基因）检出的1级和2级突变相比，9基因panel的覆盖率为78.6%（110/140个突变）。9基因panel未覆盖以下 1 级或 2 级突变：ARID1B、BRAF、CDH1、CDK12、CDKN2A、CTNNB1、FBXW7、KMT2A、LZTR1、MSH3、MSH6、MUTYH、NF1、NF2、NOTCH1、NRAS、PTCH1、RAD51D、SETBP1、SMAD4、SMARCA4 和 WT1（图 2C（e））。CNV最常见于CCNE1（2.5%，2/79）、MYC（7.6%，6/79）、KRAS（1.3%，1/79）和PIK3CA（3.8%，3/79）。总体而言，使用CABANA算法，在13.9%（11/79）的患者中检测到CNV，基于ctDNA的CNV与基于组织NGS的CNV的一致性为88.6%。92.8%的ctDNA样本检测到组织样本检出的TP53突变（64/69组织NGS样本TP53突变）。TP53突变的一致性为90.4%，灵敏度为92.8%，特异性为84.0%。

基于ctDNA趋势的分类

根据基线和 3 或 6 个月时 ctDNA 的动态变化，将患者分为三组：阴性组、清除组和持续组。阴性组包括基线ctDNA样本未检出致病性突变的患者。清除组包括基线ctDNA检出致病性突变，但3或6个月时的随访样本未检出致病性突变的患者。持续组包括基线检出致病性突变且3或6个月时持续检出致病性突变的患者。

在 201 例卵巢癌患者中，143 例有基线（T0）、3 个月（T1）或 6 个月（T2）时的ctDNA 样本。为了确定后续ctDNA采样的最佳时间点，分别评估了两种时间点组合。T0-T1阴性组、清除组和持续组的患者比例分别为 28.7%、32.2% 和 39.2%，T0-T2 分别为 28.7%、49.7% 和 21.7%。两种时间点选择均导致三个临床组的显著PFS差异（p均< 0.0001）；然而，T0-T2表现出更大的分离。此外，在三个临床组中，在 6 个月时（标志着常规 6 个周期辅助治疗的结束） ctDNA 持续检出致病性体细胞突变的患者，表现出显著较差的 PFS。 

因此，使用基线（T0）和 6 个月（T2）组合进行进一步的亚组分析。阴性组的中位PFS为17.9个月（范围：5.8-29.8个月），清除组为19.0个月（范围：4.3-32.8个月），持续组为6.7个月（范围：1.6-33.1个月）。清除组与阴性组的PFS没有差异（p = 0.41）。而清除组与持续组（p = 0.001）以及阴性组与持续组（p = 0.001）的PFS存在显著差异。亚组分析进一步显示，基于基线（T0）和 6 个月（T2）的 ctDNA 趋势对 PFS 具有高度预测性，无论临床分期（早期与晚期）（图 3A）、治疗环境（新诊断与复发）、维持治疗的使用和接受的手术类型（PDS 与 IDS）如何。Cox比例风险模型分析显示，初始治疗后6个月持续检测到ctDNA突变与PFS较差显著相关（HR=10.7 [4.4–25.9]，p < 0.001，在调整上述临床变量后）。图 3B 显示了基线以及 3 个月和 6 个月时的 ctDNA 动态状态。在104例基线时ctDNA阳性的患者中，45%（46/104）在T1时清除。在 57 例 T1 ctDNA 阳性的患者中，26 例在 T2 时清除。此外，在 32 例 T2 时 ctDNA 持续阳性的患者中，29 例（32 例中的 91%）出现疾病进展。T3时（术后9个月），83.5%（91/109）的患者具有与T2相同的ctDNA状态（阳性或阴性），4.6%（5/109）的患者从持续转为清除，11.9%（13/109）的患者转为阳性。

图3

连续ctDNA纵向监测

中位随访 12.7 个月（范围：1.6-33.1 个月）后，201 例患者中有 73 例出现疾病进展。在纵向样本分析中，27 例患者被排除在外，原因包括连续样本少于 3 个（n = 19），临床复发后 3 个月内未收集随访 ctDNA 样本（n = 2），以及基线时未检测到突变（n = 6）。连续 ctDNA、每3 周一次 CA-125 和每3个月一次影像学评估的结果如图 4A 所示。在 46 例患者中，44 例（95.7%）连续收集样本一致检出基线突变。此外，与 CT 相比，连续 ctDNA 检测在更早的时间点检测到复发，中位提前 2.0 个月（范围：0-8.8 个月），39.1%（18/46）的患者提前 >1 个月。在 26 例肿瘤细胞减灭术和辅助化疗后 CA-125 水平降至正常上限以下的患者中，ctDNA 检测比基于 GCIG 标准的 CA-125 评估更早发现疾病进展，中位早 2.3 个月（范围：0-8.3 个月），57.7% 的患者（15/26）早 > 1 个月；图 4B 展示了一个案例。在接受和未接受维持治疗的患者之间，ctDNA检测发现疾病复发的提前时间没有差异（p = 0.717）。

图4

讨 论

我们前瞻性地获得了 296 例患者的 ctDNA 样本，包括 201 例卵巢癌患者和 95 例良性或交界性附件肿块患者。根据本研究结果，ctDNA反映了患者特异性肿瘤突变，纵向样本可以有效地确定疾病复发。此外，根据基线和诊断后 6 个月的 ctDNA 动力学将患者分为阴性组、清除组和持续组，对 PFS 具有高度预测性。ctDNA具有预后价值，无论临床分期和辅助或维持治疗的使用如何。此外，每 3 个月评估一次时，ctDNA 相比 APCT 或 CA-125 评估等传统监测工具可以更早地检测到疾病进展。 

早期关于卵巢癌cfDNA或ctDNA的研究多数分析基线样本。例如，基线 cfDNA 与肿瘤负荷和疾病进展相关。基线ctDNA的预后价值也有报道。两项研究表明了使用多基因panel进行基于ctDNA的监测的可行性；然而，分析的患者数量较少，分别只有 2 例和 12 例患者。在这种情况下，就患者和样本数量而言，我们的卵巢癌队列是最大的队列之一。此外，本研究是迄今为止唯一一项包含维持治疗（如PARP抑制剂和贝伐珠单抗）使用信息的研究。由于我们在给定时间内前瞻性地纳入了单机构所有卵巢癌患者，因此患者人口统计学是全面的，反映了三级医院的临床环境。

在ctDNA突变谱的解读方面，我们只包括了1级和2级致病性变异，因为关注特异性对MRD检测很重要。如果我们纳入意义未明的 3级变异，灵敏度可能提高，但牺牲了特异性。使用这种方法，我们发现ctDNA致病性突变与组织NGS基本一致，不仅在突变基因方面，而且在所涉及的特定致病性变异方面。88.6%的一致性高于先前报告的79-81%。这些数据支持基于血液样本的ctDNA反映了患者特异性肿瘤分子谱。

有几个ctDNA突变肿瘤NGS未检出。此外，未在良性/临界患者中发现致病性突变，提示基于ctDNA的分析具有高度特异性。因此，我们不能假设仅 ctDNA 突变是假阳性，因为肿瘤组织 NGS 可能由于肿瘤内异质性或其他未知的潜在原因未检测到真正的突变。肿瘤平行分子检测似乎是提供精确信息的最佳策略。然而，由于肿瘤组织活检具有侵入性，且经常不可能，ctDNA样本可以提供有价值的临床信息。

我们的ctDNA样本检出的致病性变异与COSMIC数据库中先前报道的变异基本一致，且突变类型与组织学类型相关。在本研究中，HGSC 患者致病性 TP53 突变的检出率为 67.1%，在既往卵巢癌 ctDNA 研究报道的 66.7-86% 范围内。然而，一些基于肿瘤组织的研究也报告了TP53致病性突变的较高检出率（72-96.7%）。透明细胞癌患者的 ARID1A/PIKC3CA 突变率为 50%，在先前报道的 50.0-66.7% 范围内。除SNV外，ctDNA样本还提供CNV信息，尽管检出率（13.9%）低于基于组织的NGS（20.3%）。Noguchi等人评估了ctDNA MET和EGFR突变，Nakabayashi等人评估了cfDNA分析用于无创产前检测，我们基于ctDNA的CNV检出率低于这两项研究报告的19.6%和16.7%。因此，我们推测使用更大的测序panel可能会提高CNV检出率。 

我们panel的大小是值得注意的。既往卵巢癌ctDNA研究使用了包括55-500个基因的NGS panel。在我们研究的试点阶段，我们设计了一个包括卵巢癌高频变异基因的panel。使用更简洁的panel，包括TP53、BRCA1 和 BRCA2 这三个基因，可以轻松检测致病性突变。而在panel中添加 ARID1A、PIK3CA、KRAS 和 PTEN 基因（7 个基因）可能提高灵敏度，因为其对非浆液性癌具有特异性。我们还评估了9基因panel相比基于组织的532基因panel的覆盖率（78.6%）。如果添加经常在 FFPE 检测中发现的 NF1 和 CDK12 用于额外 HGSC 覆盖以及 NRAS 用于低级别浆液性癌，预计定制panel的灵敏度和特异性会提高。此外，除了 SNV 之外，为了捕获 CNV，还需将 MYC 和 CCNE1 基因包含在 panel 中。我们目前的9基因panel 既具有成本效益又高效，有可能被纳入大规模筛查计划，以及CA-125评估的辅助检测，用于卵巢癌管理。

我们基于ctDNA动力学分析的结果具有重要的临床意义。基于 Kaplan-Meier 曲线，确定了辅助治疗环境中随访采样的最佳时间点。关于OR，3个月时的ctDNA检测（对应3个周期的辅助治疗和影像学评估时间）不如6个月时的（标志着常规6个周期的铂类辅助化疗的结束）。这一发现与 Elena 等人的相似，该研究表明，基于微滴式 PCR 检测，6 个月时检测不到的 ctDNA 水平与 PFS 改善相关。6个月时持续存在ctDNA与不良PFS独立相关，HR为10.7，即使考虑其他相关临床参数。根据我们的结果，基于两个采样时间点的ctDNA分析可能提供临床上有用的信息，因为大多数卵巢癌患者诊断时处于晚期，接受辅助化疗。6 个月时的 MRD 状态可能有助于确定哪些患者可能获益于强化监测或治疗，如额外的化疗周期、使用联合方案或增加维持治疗。相比之下，如果 6 个月时没有致病性突变，则提示强度较低的监测或不进行贝伐珠单抗或 PARP 维持治疗的可能性。

关于监测，在94%的疾病进展患者中，随访样本具有与基线样本相同的致病性变异，提示患者基线突变谱具有高度特异性，在基于ctDNA的监测方案中是有用的。与之前一项关于 TP53 突变在卵巢癌监测中的有用性的研究类似，我们发现 TP53 是一个重要的监测生物标志物。此外，在检测时间方面，与目前使用的方法（每3个月一次APCT 或每3周一次CA-125 评估）相比，连续 ctDNA 检测更早地发现疾病进展。对于大约 15% 的卵巢癌进展、CA-125 水平未升高的患者，基于 ctDNA 的监测可有效识别复发。早期识别疾病进展的能力可以为临床医生提供相当大的灵活性。例如，患者可能会接受筛查和额外的免疫组织化学检测以参与临床试验。此外，能够对复发迹象及早采取行动，这可能会提高在低疾病符合环境中更有效的特定治疗的疗效。

本研究有几个局限性。首先，仅一小部分患者进行了组织NGS。其次，由于观察期短，一些患者失访，只能对至少有四个连续样本（包括基线样本）的患者进行纵向监测分析。第三，研究后期入组的患者亚组观察期相对较短，增加了右删失样本。然而，Kaplan-Meier 图中使用的对数秩检验在比较不同观察期内生存分布的相等性方面非常有效。第四，我们的panel仅限于九个基因。尽管我们的panel在成本效益和效率方面具有优势，但遗传信息仅限于我们panel中包含的基因。 

与传统方法（如每3个月一次APCT或CA-125评估）相比，使用tumor-naïve小测序panel分析连续 ctDNA 可有效检测 MRD 和及早发现疾病进展。在大队列卵巢癌患者中，我们进一步确定了MRD检测的最佳随访采样时间点为6个月时。此外，即使在接受贝伐珠单抗或PARP抑制剂维持治疗的患者中，早期发现疾病进展的能力也没有受到影响。本研究结果强调了将连续ctDNA测序纳入卵巢癌临床管理的潜力。这些发现产生假设，有可能用作未来临床试验的参考。 

参考文献：

Heo J, Kim YN, Shin S, Lee K, Lee JH, Lee YJ, Choi Z, Park J, Min S, Kim SW, Choi JR, Kim S, Lee ST, Lee JY. Serial circulating-tumor DNA analysis with a tumor naïve next-generation sequencing panel detects minimal residual disease and predicts outcome in ovarian cancer. Cancer Res. 2023 Dec 1. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-23-1429. Epub ahead of print. PMID: 38038965.