文献荐读｜胡兴胜教授：由IGF2BP3驱动的代谢重编程促进非小细胞肺癌对EGFR-TKIs的获得性耐药

01 研究背景

肺癌是癌症相关死亡的主要原因，其中非小细胞肺癌(NSCLC)约占85%。自1997年以来，从第一代厄洛替尼到第三代奥希替尼，EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)在非小细胞肺癌的靶向治疗中具有显著的临床疗效。不可避免的是，越来越多的患者对靶向治疗产生耐药性，这对TKI治疗是一个巨大的挑战。因此，目前迫切需要探索潜在的耐药机制并制定有效的策略来克服TKI获得性耐药的发生。

代谢适应是肿瘤为满足恶性细胞对生物能量、生物合成和解毒不断增加的需求而存在的。代谢重编程指肿瘤的代谢特性和偏好在肿瘤进展中发生改变，这可能是耐药的发生机制。与经典的Warburg效应相反，Sarry等人观察到阿糖胞苷耐药的AML细胞和患者表现出氧化磷酸化(OXPHOS)活性升高，OXPHOS抑制剂可以使耐药AML细胞对阿糖胞苷敏感。然而，目前尚不清楚NSCLC细胞是否可以通过代谢适应来重建其微环境，从而产生耐药。

人胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白家族(IMP2/IGF2bp)是一类包含2个N端RNA识别结合区(RRM)和4个C端异源核糖核蛋白KH结构域的胚胎蛋白，可结合目标mRNA编码区域，调控RNA转运、翻译和降解，并进一步参与发育、肿瘤发生和干细胞形成等一系列生物学过程。近期研究表明IGF2BP3家族是N6-腺苷酸甲基化阅读蛋白，KH结构域为识别m⁶A GC序列的核心结构域，可促进下游靶基因mRNA的稳定和翻译。近年来，多项研究发现基因的转录后调控因子IGF2BP3参与肿瘤细胞的增殖、侵袭和化疗耐受。IGF2BP3在多种肿瘤中表达上调，并与患者预后不良相关。然而，其具体作用机制和潜在的功能尚不清楚。

02 研究对象及方法

通过对原代组织样本和细胞系培养、构建质粒、转染细胞和病毒感染等操作构建了敲除和过表达细胞系，并对稳转细胞系进行了Western-blot分析、qRT-PCR检测、细胞活力测定、细胞增殖试验、克隆形成试验和微球形成试验、细胞凋亡分析、RNA测序、RNA免疫沉淀测序、Seahorse检测、荧光素酶报告基因试验和诱变试验、m⁶A-RNA免疫沉淀试验（RIP）等，并对细胞的ROS、ATP、线粒体膜电位水平（MMP）、代谢组学、NAD+/NADH、RNA和蛋白质的稳定性进行了测定。此外，作者利用BALB/c裸鼠构建了Dox-shIGF2BP3皮下肿瘤模型和IGF2BP3过表达皮下肿瘤模型，并进行了IGF2BP3皮下肿瘤模型的拯救实验。最后，作者构建了NSCLC患者来源的类器官模型（PDO）并进行活性测定。

03 结果

一 IGF2BP3在获得性EGFR-TKI耐药的NSCLC中上调

对比长期接受TKI治疗的获得性耐药NSCLC肿瘤和TKI敏感NSCLC肿瘤的转录组数据，并对比TKI耐药NSCLC样本和HCC827细胞转录组数据的DEGs和三个独立临床GEO队列数据库的DEGs，发现与NSCLC获得性TKI耐药相关的4个上调基因和3个下调基因，IGF2BP3是其中一个上调基因，与多种肿瘤耐药相关。7种NSCLC细胞系IGF2BP3蛋白表达均上调。免疫组化显示IGF2BP3在NSCLC组织中显著上调。与正常组织或TKI敏感样本相比，获得性TKI耐药样本IGF2BP3 mRNA和蛋白显著升高，细胞试验结果相同。以上结果均支持IGF2BP3介导NSCLC TKI获得性耐药的发生。

二 IGF2BP3促进NSCLC获得性EGFR-TKI耐药发生

IGF2BP3敲除使得敏感和耐药NSCLC细胞系对吉非替尼的敏感性显著增加。吉非替尼可显著降低IGF2BP3耗竭NSCLC细胞系的细胞增殖、克隆形成和微球形成能力。流式细胞术结果也显示IGF2BP3耗竭导致细胞凋亡显著增加，对吉非替尼的敏感性增强。相反，IGF2BP3过表达使得两种吉非替尼敏感NSCLC细胞系的敏感性降低。小鼠模型中，IGF2BP3敲除细胞系皮下移植瘤体积和质量较小，对吉非替尼的敏感性较高，而IGF2BP3过表达皮下移植瘤生长迅速，对吉非替尼的敏感性较低。（下图）

三 在获得性EGFR-TKI耐药的NSCLC中，IGF2BP3通过COX6B2介导线粒体能量重编程

生物能量分析表明，与TKI敏感细胞系相比，TKI耐药细胞的胞外酸化率（ECAR）略有下降，线粒体氧耗率（OCR）高出近2至3倍，表明其存在高水平OXPHOS。此外，线粒体OXPHOS复合体、总ROS、线粒体ROS、ATP和MMP水平在TKI耐药细胞系中均显著上调，均提示TKI耐药细胞系拥有更高的OXPHOS能力，可产生大量ATP用于供能。COX6B2敲除细胞系OXPHOS水平显著降低，ROS生成和ATP生成显著减少。IGF2BP3稳定敲低细胞系的OXPHOS能力明显降低，而进一步过表达COX6B2可明显改变这种情况。PC-9/GR和PC-9细胞系中，总ROS、线粒体ROS、ATP和MMP水平与IGF2BP3表达呈正相关， IGF2BP3的敲低可被COX6B2过表达逆转。综上，IGF2BP3-COX6B2轴在TKI耐药细胞系的代谢重编程中起关键作用。（下图）

四 IGF2BP3以依赖m⁶A的方式调控COX6B2的翻译

与TKI敏感细胞系相比，TKI耐药细胞系COX6B2表达上调，两种细胞系中COX6B2和IGF2BP3蛋白水平均呈正相关。IGF2BP3敲低细胞的COX6B2 mRNA和蛋白半衰期显著降低，而IGF2BP3过表达细胞的COX6B2半衰期显著增加，表明IGF2BP3可增加NSCLC中COX6B2 mRNA的稳定性。此外，研究发现m⁶A修饰缺陷细胞系中COX6B2下调，半衰期显著降低，而IGF2BP3保持不变，给予外源野生型m⁶A修饰的细胞可逆转这一改变，表明IGF2BP3可能以依赖m⁶A的方式调控COX6B2的翻译。对稳定过表达IGF2BP3的细胞系进行IGF2BP3-RIP和m⁶A-RIP检测，发现IGF2BP3与COX6B2 mRNA的结合以及COX6B2 mRNA的m⁶A水平均显著升高。上述结果表明，COX6B2 mRNA的m⁶A修饰是IGF2BP3结合和诱导NSCLC细胞耐药的必要条件。（下图）

五 OXPHOS抑制剂可增强EGFR-TKIs的疗效

小分子OXPHOS抑制剂IACS-010759可显著增加耐药细胞对吉非替尼的敏感性。同样，IACS-010759联合吉非替尼处理TKI耐药细胞系可诱导凋亡，抑制增殖和集落形成。裸鼠PC-9/GR细胞建立的CDX和PDX模型结果同体外试验一致，IACS-010759联合吉非替尼可显著抑制耐药CDX/PDX的生长，且未观察到明显的毒副反应。上述结果从多方面证明了OXPHOS抑制剂在TKI耐药模型中的作用，提示OXPHOS抑制剂具有恢复NSCLC患者对TKI敏感性的潜力。

04 结论

靶向IGF2BP3可以显著增强NSCLC对TKIs的敏感性，其效果与IGF2BP3在线粒体OXPHOS能量传递中的关键下游靶点COX6B2的协调显著相关。从机制上讲，IGF2BP3可以m⁶A依赖的方式结合到COX6B2的3'非翻译区来增加COX6B2 mRNA的稳定性，从而增加氧化磷酸化、调节烟酰胺代谢，最终驱动肺癌对EGFR-TKI产生治疗抵抗。此外，IACS-010759 对吉非替尼耐药的PDX模型产生强烈的生长抑制作用，表明OXPHOS抑制剂对TKI耐药的NSCLC具有治疗潜力。总而言之，该研究揭示了NSCLC TKI获得性耐药的新机制，即IGF2BP3-COX6B2轴介导的表观遗传修饰和代谢重编程之间依赖IGF2BP3的交互作用，提供了通过靶向代谢改变来克服获得性耐药的新思路。

主编评语

该研究报告了代谢重编程相关分子机制在驱动NSCLC获得性EGFR-TKI耐药中的关键作用。基于生物测定、转录组测序和患者样本信息，作者首次证明了IGF2BP3在EGFR-TKI耐药的NSCLC中上调，IGF2BP3的高表达与较差的临床预后和较高的病理分期显著相关，进一步明确了IGF2BP3的致癌作用。此外，IGF2BP3敲除NSCLC细胞系的增殖和球化能力下降，凋亡增加，对吉非替尼的敏感性提高。IGF1R抑制剂利西替尼联合吉非替尼可有效提高NSCLC的疗效，提示靶向IGF2BP3可能是克服NSCLC获得性耐药的有效策略。

为了阐明IGF2BP3介导NSCLC TKI耐药的分子机制，作者在富集分析的基础上，将重点放在与人类癌症耐药高度相关的代谢途径上，确定了IGF2BP3作为下游靶点。当糖酵解被抑制时，肿瘤可激活其他替代途径来维持生存。生物能量学分析表明，与敏感细胞相比，耐药NSCLC细胞系OXPHOS、ROS、ATP和MMP水平显著提高，表明代谢重编程是耐药肿瘤的潜在治疗靶点。此外，该研究发现COX6B2的存在可有效缓解IGF2BP3耗竭引起的代谢紊乱，证实IGF2BP3-COX6B2轴在TKI耐药的NSCLC代谢重编程中起关键作用，氧化还原酶COX6B2可作为潜在候选靶点。最后，作者确定依赖m6A修饰的COX6B2是IGF2BP3的直接下游靶点，并通过代谢组学分析确定烟酰胺可通过调节细胞内NAD水平驱动TKI耐药NSCLC的OXPHOS代谢。

总之，该研究发现IGF2BP3在TKI耐药NSCLC中以m6A依赖的方式发挥重要作用，IGF2BP3-COX6B2轴是TKI耐药的关键调节因子，并与表观遗传修饰和线粒体功能相关。重要的是，代谢性重编程在TKI耐药NSCLC中起着至关重要的作用，OXPHOS抑制剂是克服NSCLC获得性耐药的潜在治疗选择。