IVD前沿丨cfDNA数据检测于临床新应用

许多类型的细胞在凋亡、坏死或活跃分泌时释放cfDNA到血浆、尿液和其他细胞外液中。CfDNA片段来源于细胞死亡后核小体经核酸酶酶切形成的DNA片段，因此，CfDNA片段化与核小体高度相关，可用于推断起源组织中的核小体定位、转录因子结合、基因表达和DNA甲基化状态。迄今为止，许多追踪cfDNA起源组织的策略都受到了限制，因为需要了解不同组织类型之间的遗传差异。

近日，杂志Nature communications上发表了一篇题为“Cell type signatures in cell-free DNA fragmentation profiles reveal disease biology”的文章。作者开发了一种方法，利用单细胞转录组图谱从头扫描cfDNA片段图谱，以获得健康和疾病中一系列潜在的细胞类型贡献者。这种方法在多种癌症类型和妊娠并发症中广泛适用于疾病生物学探索、生物标志物发现和患者分类。还证明了细胞类型特征可以从超低覆盖率的cfDNA数据中推断出来。期望该方法将扩大标准护理全基因组NIPS和液体活检数据在各种病理(包括癌症)中的临床应用。

图片来源：Nature communications

主要内容

研究方法

CfDNA片段化与核小体高度相关，可用于推断起源组织中的核小体定位、转录因子结合、基因表达和DNA甲基化状态。作者整合了公开的单细胞转录组数据，以获得对血浆cfDNA的有贡献的潜在细胞类型。根据相关性的强度对细胞类型进行排序。作者比较了健康和疾病队列之间的细胞类型排序，以确定在血浆cfDNA中相对过多或过少的细胞类型。最终，新病例的疾病状态可以通过构建使用细胞类型排名作为输入的分类器来预测。

研究方法示意图。图片来源：Nature communications

不同的cfDNA测序深度下的核小体动力学

首先测试了是否可以使用窗口化保护评分(WPS)在全基因组cfDNA测序数据中可靠地捕获核小体定位。在230个健康cfDNA样本中，进行35倍(n = 1)、10倍(n = 139)或<0.3倍覆盖深度(n = 90)测序，核小体定位结果与231倍覆盖深度绘制的核小体位置一致(图B)，且相邻核小体之间的距离为187 bp，符合核小体重复长度(图C)。这些发现表明，即使在极低的测序覆盖率下，单核小体信号也保留在cfDNA片段谱中。

CfDNA超低测序深度也可保存细胞类型特征信息。

图片来源：Nature communications

健康人血浆中cfDNA的细胞类型组成

结果显示，所有测序深度的健康个体血浆中的cfDNA样本与免疫细胞类型的相关性最强，其次是内皮细胞、基质细胞和上皮细胞类型(图D)。健康状态下单核细胞和淋巴细胞对cfDNA的贡献最大，特别是单核细胞、调节性T细胞、自然杀伤T细胞、CD8+ T细胞和naïve B细胞。

健康人血浆中cfDNA的细胞类型组成。

图片来源：Nature communications

性别特异性细胞类型对cfDNA的贡献

比较了男性和女性性别特异性组织的细胞类型对cfDNA的贡献。在子宫的非造血细胞类型中，所有不同排名的细胞类型在女性中的排名都高于男性。相反，男性前列腺中所有不同排名的细胞类型的排名都高于女性(图B)。总之，这些发现支持此方法在cfDNA数据中识别非造血细胞类型的能力。

性别特异性细胞类型对cfDNA的贡献。

图片来源：Nature communications

妊娠特异性细胞类型对cfDNA的贡献

作者还测试了怀孕期间胎盘对cfDNA的预期贡献。结果显示，当按组织分组时，怀孕和未怀孕个体之间唯一有差异的细胞类型来自胎盘(图C)。绒毛外滋养层细胞(EVT)排名最高，其次是增殖性EVT，绒毛滋养细胞(VCT)，增殖性VCT和合体滋养层细胞(SCT)（图E）。这一过程反映了滋养细胞分化的轨迹。

妊娠特异性细胞类型对cfDNA的贡献。

图片来源：Nature communications

在癌症患者中，细胞类型对cfDNA的贡献异常

作者接下来检测癌症患者血浆cfDNA中异常细胞类型的贡献。在结直肠癌队列中，有122种过度代表的细胞类型和134种未充分代表的细胞类型(图A)。大多数排名增加的细胞类型是上皮细胞，其次是基质，内皮细胞和免疫细胞。结肠直肠癌患者中最过度代表的细胞类型是肠道CD4+ α/β T细胞，且等级与cfDNA中肿瘤分数呈正相关(图B)。

在乳腺癌队列中，检测到73种过度代表的细胞类型和83种未充分代表的细胞类型(图C)。在乳腺癌中排名较高的细胞类型中，80%是免疫细胞，其中巨噬细胞的相对排名特别高。巨噬细胞被认为促进了恶性乳腺癌前期癌细胞的早期传播。乳腺癌队列中纤毛细胞的贡献显著减少。巨噬细胞和纤毛细胞的等级与肿瘤分数无关，但由于队列没有跨越一系列癌症阶段，将细胞类型与疾病进展联系起来的能力有限(图D)。

测试此方法是否可以在超低测序深度数据中检测细胞类型特异性疾病特征，作者比较了超低覆盖率多发性骨髓瘤样本分析中，与对照组相比，浆细胞样树突状细胞、浆细胞、浆母细胞、B细胞和髓系祖细胞是排名前20位的细胞类型。在多发性骨髓瘤患者中，浆细胞等级与肿瘤分数密切相关，支持在超低测序深度下的灵敏度。

在癌症患者中，细胞类型对cfDNA的贡献异常。

图片来源：Nature communications

细胞类型特征预测癌症

接下来，作者研究了在预测分析中是否可以将个体癌症患者与对照组区分开来。作者训练了一个支持向量机，并对每种癌症类型评估了监督模型的性能。ROC分析得出，结直肠癌的平均ROC曲线下面积(AUC)为84.7%，乳腺癌为90.1%，多发性骨髓瘤为95.0%(图G)。即使使用外部超低覆盖深度(<0.3倍)测序数据，也能获得阳性预测值82.6和阴性预测值89.6(图H)。这证明了此模型能够跨测序深度和研究中心推广结直肠癌的分类。

细胞类型特征预测癌症。图片来源：Nature communications

细胞类型特征与妊娠并发症有关

然后，作者测试了妊娠并发症中异常细胞类型对cfDNA的贡献。18例子痫前期妊娠中，在cfDNA前10位的过度代表细胞类型中发现了AFP+ ALB+细胞滋养细胞、肝脏中性粒细胞和单核细胞(图A)。肝损伤是子痫前期最常见的后遗症之一，驻留在肝脏的中性粒细胞过多可能是这种肝损伤的结果。使用支持向量机，可将诊断时的子痫前期妊娠与胎龄匹配的对照妊娠区分开来，AUC为88.3%(图B)。最后，作者研究了双胎消失征，但预测分析无法区分双胞胎消失的个体妊娠与表现良好的对照组(AUC < 60%)。

细胞类型特征与妊娠并发症有关。

图片来源：Nature communications

总结与讨论

作者将单细胞转录组图谱与cfDNA片段模式结合起来，对血浆cfDNA细胞类型贡献者进行全面表征。在744名健康个体和患者中，作者发现了支持肿瘤和产前护理中新出现的疾病范式的细胞类型特征。训练的预测模型能够将结直肠癌(84.7%)、早期乳腺癌(90.1%)、多发性骨髓瘤( 95.0%)和先兆子痫(88.3%)患者与匹配对照区分开来。重要的是，此方法在超低覆盖率的cfDNA数据集中表现良好，并且可以很容易地转移到不同的临床环境中进行液体活检的扩展。

方法的一个局限性是，如果一种细胞类型与细胞类型贡献者共享转录组谱，那等级可能会被虚假地提高。总之，该方法在超低测序深度下的敏感性，使大规模病例对照队列的测序具有成本效益，可用于疾病特征发现和分类模型。使用该方法，作者看到了扩大标准护理产前筛查(NIPS)和液体活检数据在癌症和各种情况下的临床应用的潜力。