Cell Reports Medicine：多模态cfDNA基因组和片段组学模式可增强癌症生存率和复发分析

液体活检，特别是无细胞DNA（cfDNA）检测，已在临床肿瘤学中得到了积极的研究。基因突变和体细胞拷贝数异常（SCNA）等是精准肿瘤学有前景的候选生物标志物。ctDNA突变检测通常受到技术和生物噪声的限制，甲基化和片段组学测序已成为潜在的敏感和成本有效的替代方法。

近日，英国曼彻斯特大学癌症研究所的Florent Mouliere研究团队在Cell Reports Medicine发表了题为“Multi-modal cell-free DNA genomic and fragmentomic patterns enhance cancer survival and recurrence analysis”的文章。基于全基因组测序，研究团队开发了片段末端综合分析（FrEIA）评分，可使用低覆盖率全基因组测序（WGS）定量评估液体活检样本。研究团队利用FrEIA检索cfDNA片段端组成，以及三个独立队列的cfDNA大小和肿瘤分数。结果显示，在95%的特异性下，使用至少一种cfDNA检测方法检测出72%的癌症样本，包括64%的早期癌症。此外，cfDNA检测与可切除食管腺癌患者较短的总生存期和无复发生存期相关。在独立测试集中，将cfDNA检测与机器学习相结合，检测准确率为82%，AUC为0.96。因此，利用cfDNA生物学特性可以提高癌症液体活检的诊断性能，结合基于突变的肿瘤分数检测，这些指标提高了癌症检测的敏感性。此外，研究团队证明了这些综合cfDNA指标对癌症患者的预后和预测价值。

文章发表在Cell Reports Medicine

图1.人类癌症细胞的异种移植小鼠模型中的cfDNA指标。

主要研究内容及结果

该研究目标是通过挖掘和结合基因和片段组学模式来提高基于cfDNA的非侵入性癌症分析的敏感性。研究团队假设cfDNA片段端模式、短片段比例和SCNA肿瘤分数（ichorCNA TF）的变化，都可以从相同的低覆盖率WGS样本中获得，可以用来改善癌症患者的检测和管理。

cfDNA的生物学特征在癌症中发生改变

首先，研究团队使用来自629名患者（包括21种不同癌症类型）的925份血浆样本、306份对照样本和15份未分类肺结节（或其他肺部病变）患者的样本生成了cfDNA生物特征目录（图2A）。总体来说，共收集了来自3个不同队列治疗前的628个样本，治疗后的297个样本。

为了表征和评估WGS中cfDNA片段末端三核苷酸模式，研究人员开发了FrEIA工具包。根据cfDNA片段末端5 '端前三个碱基的频率（64个特征）将其归类为泛癌。与对照样本相比，癌症样本中14个5 '三核苷酸片段末端序列相对比例显著降低，26个相对比例显著增加（图2B）。所有癌症类型的片段末端序列折叠变化趋势相似，与健康对照片段相比，以CCA、CCC或CCT开始的片段减少最多，以TTC、TTA或ATG开始的片段增加最多，这表明癌症中cfDNA裂解的常见机制与癌症类型无关。（图2）

图2.检测癌症cfDNA生物学特征在癌症中发生的改变

经分析，片段末端序列具有较高的保真度，可以用于分析。与健康个体相比，由于癌症患者血浆cfDNA的5′端序列比例发生了变化，因此研究人员将这些比例整合到FrEIA评分的单一定量检测中。与对照组相比，每个队列的每种癌症类型的FrEIA评分都增加；使用Gini指数评估的5 '端三核苷酸序列的多样性在9种癌症类型中有7种与对照组相比有所增加（图2D、E）。在所有三个队列中，与健康对照个体相比，检测到癌症患者的模式为~ 167bp，并且短片段丰富（图1F）。在此基础上，研究团队选择了20~150bp之间的范围，并计算了其比例。7种癌型患者P20-150升高（图2G）。

为了证明cfDNA生物学特征与癌症之间的强烈关联，研究团队对16只移植了人类癌症大肠癌细胞系小鼠的血浆样本进行了分析。研究发现，癌症患者的三核苷酸末端比例与结直肠癌移植物之间存在显著相关性。总体而言，该研究结果有力地支持cfDNA生物学特征与癌症之间的联系。（图3）

图3.人类癌症细胞异种移植小鼠模型的cfDNA生物学特征。

cfDNA生物特征的整合改进癌症检测

由于癌症信号可以从各种形式的cfDNA生物特征中检索到，研究团队分析了它们的联合使用是否会改善癌症检测。在95%的特异性下，FrEIA评分检测到269/628例（43%）治疗前肿瘤样本，P20-150检测到180/628例（29%）样本。对于ichorCNA TF，假设3%的TF检测阈值，检测了199/628（32%）个治疗前癌症样本（图4A）。

总共454/628份（72%）癌症治疗前样本至少被一种方法检测到，特异性为95%。此外，61%的I期、79%的II期、68%的III期和76%的IV期肺癌样本至少通过一种cfDNA检测到。与基于突变的检测技术相比，cfDNA生物特征的整合在检测癌症样本方面表现稍好（图4B、C）。

接下来，研究团队分析了通过机器学习方法整合cfDNA特征是否会改善癌症分类。数据显示，逻辑回归对分类性能的估计最高（准确率0.82）（图4D）。最佳模型检验显示，在检测概率限为50%的情况下，采用指标组合的模型表现最佳（AUC = 0.96，阳性预测值[PPV] = 0.99，阴性预测值[NPV] = 0.49）（图4E）。基于指标组合的分类器特异性为95%，检测到63% I期、66% II期、74% III期和83% IV期肺癌，以及77% II期和81% III期rEAC样本（图4F）。以上结果表明，即使在疾病的早期阶段，整合cfDNA生物特征的指标也可以提高从浅WGS数据中检测癌症的能力。

图4.cfDNA生物学特征与生理学变量的相关性。

结合cfDNA生物学特征改善癌症患者的临床管理

研究团队评估cfDNA生物学特征综合检测在真实临床环境中的意义。研究团队评估了2个临床队列的293个可切除食管腺癌样本的综合措施的潜力（图5）。病理学家从切除样本中确定不完全缓解的患者，CRT新辅助治疗后和术前的FrEIA评分较治疗前显著增加，病理完全缓解的患者无差异（图5B）。部分/无缓解的患者，CRT新辅助治疗后和术前的FrEIA评分均较治疗前显著升高，完全/次优缓解的患者，CRT新辅助治疗后和术前的FrEIA评分无显著差异（图5B）。以上结果表明，多个cfDNA指标量化的动态变化与切除前治疗反应的预测和组织学评估有关。

图5.利用cfDNA生物学特征对癌症进行检测和分类。

由于手术后血液循环中肿瘤信号非常微小，对于初次接受液体活检检测的患者来说，预测手术后复发具有挑战性。使用低覆盖率WGS，研究团队在随访样本中检测到55%的早期复发患者和8%的未经历临床复发患者中的4个cfDNA特征之一，至少一个或多个cfDNA检测值高于阈值的患者从手术时起的生存期更短。这证明了对不同恶性肿瘤进行多信号分析的潜在临床实用性。（图6）

图6. cfDNA生物学模式能够监测和预测癌症的复发。

结语

该研究团队评估了是否可以利用从相同样本和测序数据中获得的多种生物特征来提高在一系列临床应用中检测癌症信号的灵敏度。研究团队使用来自三个独立的低成本、低覆盖率WGS队列的925份血浆样本的泛癌数据集，证明了整合基因组和片段组学特征可以增强早期癌症的检测，提供了作为预后生物标志物的价值，并用于监测系列样本的复发。

研究团队新开发的FrEIA评分，能够以可重复的方式从WGS数据中恢复cfDNA片段末端序列，可用于低覆盖率的WGS，也可用于更高深度的WGS或其他形式的双端测序。cfDNA基因组和片段组学特征的多信号组合有可能使用WGS对ctDNA进行灵敏检测，为癌症的早期检测提供信息，并有助于低成本解决癌症患者后续治疗的挑战。

论文原文：

Moldovan N, van der Pol Y, van den Ende T, et al. Multi-modal cell-free DNA genomic and fragmentomic patterns enhance cancer survival and recurrence analysis. Cell Rep Med. Published online December 18, 2023. doi:10.1016/j.xcrm.2023.101349

https://doi.org/10.1016/j.xcrm.2023.101349