JOSR：FOXO1通过METTL3信号通路调控牙周韧带干细胞成骨分化

牙周炎是发生在牙周组织的慢性炎症。该病由微生物(如变形链球菌、牙龈卟啉单胞菌、葡萄球菌)引起。这些微生物斑块的积累破坏了牙齿周围的结缔组织和结缔组织，也会引起口腔炎症反应。近年来，全世界牙周炎的患病率已接近50%。牙周炎的平均发病年龄也从35岁下降到30岁。

第四次全国口腔健康流行病学调查显示，我国成年人牙周健康的比例不足10%，中重度牙周炎患者占62.4%。晚期牙周炎患者通常会出现多种症状，如牙齿松动、牙龈出血和牙周脓肿。严重者可发生牙齿脱落。因此，探究牙周炎的病理就显得尤为重要。

牙周韧带干细胞(Periodontal ligament stem cells, PDLSCs)是来源于牙周韧带的干细胞。这些细胞具有自我更新能力，并表现出多向分化潜能。PDLSCs具有向牙周神经细胞、血管、牙周韧带和骨组织分化的能力。PDLSCs被认为是牙周骨再生的最佳候选材料。控制PDLSCs的分化也被认为是临床治疗晚期牙周炎患者的有效方法。

因此，对于牙周炎患者的临床治疗，迫切需要寻找促进PDLSCs成骨分化的药物和药物靶点。fox01转录因子属于Fox家族。FOXO1参与软骨分化、糖尿病、食管癌等疾病。已有研究表明FOXO1能够促进PDLSCs的成骨分化。然而，监管过程的完整机制尚不清楚。

n⁶ -甲基腺苷(m⁶A)修饰是RNA最丰富的转录组修饰之一。这种修饰作用于mRNA时具有两种生物学效应。一方面，由于结构的改变，修饰后的mRNA与靶蛋白的结合更加紧密。另一方面，招募特定的蛋白质与目标RNA结合。这些过程都是由m⁶A修饰酶(METTL3、METTL14、ALKBH5等)完成的。m⁶A甲基化修饰与干细胞的分化过程密切相关。m⁶A的甲基化修饰可影响干细胞的维持、分化、迁移等细胞功能。

此外，有研究提出m⁶A甲基化修饰可促进牙周炎患者PDLSCs的成骨分化。PI3K/AKT信号通路可调控干细胞的自我更新和多能分化。其中，多能分化包括干细胞成骨再生。PI3K/AKT通路在癌症、骨质疏松、骨折等多种疾病中被广泛研究。许多研究表明，PI3K/AKT信号通路促进PDLSCs成骨分化。此外，其他研究表明，m⁶A修饰酶METTL3介导PI3K/AKT信号通路，促进干细胞功能改变。

然而，这些研究更多地集中在焦亡或细胞损伤上。在牙周炎中，m⁶A修饰酶介导的PI3K/AKT信号通路调控PDLSCs成骨分化的完整分子机制和影响模式研究尚不完整。在此，我们研究了FOXO1调控PDLSCs成骨分化的机制。

FOXO1的过表达已在临床样本和成骨分化的PDLSCs中得到证实。体外细胞实验和救援实验均表明FOXO1通过转录激活METTL3促进pdlc的成骨分化。这一过程与PI3K/AKT信号通路有关。

方法:采用qRT-PCR检测临床组织和PDLSCs中FOXO1 mRNA的表达水平。采用碱性磷酸酶(ALP)染色和茜素红S (ARS)染色检测PDLSCs成骨分化程度。采用qRT-PCR和western blotting检测早期成骨标志物COL1A1和RUNX2的水平。利用JASPAR在线数据库预测FOXO1调控基因。

FOXO1在PDLSCs成骨分化过程中的临床表达及表达。A采用RT-qPCR检测牙周炎组和正常组患者牙周韧带中FOXO1的表达水平。B流式细胞术鉴定PDLSCs。C PDLSCs成骨分化过程中FOXO1的表达水平。RT-qPCR检测。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001

FOXO1的过表达促进了PDLSCs的成骨分化。A采用RT-qPCR检测FOXO1过表达的转染效率。细胞进行14天的成骨分化诱导。FOXO1过表达后，采用ALP染色(B、C)和ARS染色(D)检测PDLSCs的成骨分化能力。E采用qRT-PCR检测COL1A1和RUNX2 mRNA表达水平。F Western blotting检测COL1A1、RUNX2蛋白表达水平。**p < 0.01， **p < 0.001

FOXO1与METTL3的结合效应。A在线软件JASPAR预测FOXO1的结合蛋白。B采用qRT-PCR检测si-FOXO1的转染效率。采用qRT-PCR检测FOXO1过表达(C)和敲低(D)后METTL3的表达水平。抗FOXO1转染后METTL3富集的E ChIP分析。F采用RT-qPCR检测METTL3在PDLSCs成骨分化过程中的表达。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001

FOXO1通过METTL3/AKT/PI3K轴影响PDLSCs的成骨分化。细胞进行14天的成骨分化诱导。A然后用western blotting检测AKT、p-AKT、PISK和GAPDH的蛋白表达水平。B免疫印迹结果定量分析。*p < 0.05， **p < 0.01

结果:FOXO1在牙周炎患者临床标本中普遍表达水平较低。我们提供的证据表明FOXO1的过表达促进了PDLSCs的成骨分化。此外，体外和抢救实验均表明FOXO1调控METTL3。FOXO1主要通过调控PI3K/AKT通路的METTL3修饰影响成骨分化。

结论FOXO1通过转录激活METTL3激活PI3K/AKT信号通路。这种作用促进了PDLSCs的成骨分化。

文献来源： Wang Q,  Shi W,  Lin S,FOXO1 regulates osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells through the METTL3 signaling pathway.J Orthop Surg Res 2023 Aug 29;18(1)