Nature:高福/施一团队首次解析埃博拉病毒聚合酶结构

2022-09-28 传染科新前沿 “ 小柯生命”公众号

埃博拉病毒聚合酶负责病毒基因组复制过程,且具有较高保守性,是研发广谱性药物的重要靶标。但埃博拉病毒聚合酶的分子量大、不稳定、易降解,其三维结构的解析一直是世界性难题。

今年9月,非洲乌干达再次出现新的埃博拉疫情。这意味着埃博拉病毒这把“达摩克利斯之剑”依然悬在头顶,时刻威胁着人们的健康。

科学界一直想研制一款成本低、有利于推广的广谱性抗埃博拉病毒小分子药物,但却缺乏理论指导。埃博拉病毒聚合酶负责病毒基因组复制过程,且具有较高保守性,是研发广谱性药物的重要靶标。但埃博拉病毒聚合酶的分子量大、不稳定、易降解,其三维结构的解析一直是世界性难题。

现在,中国科学院微生物所高福院士团队和施一团队合作,首次解析了埃博拉病毒聚合酶复合物的三维结构,为从分子水平理解埃博拉病毒复制机制奠定了关键理论基础。他们还解析了老药苏拉明能有效抑制埃博拉病毒聚合酶活性的分子机制,为抗埃博拉病毒的药物开发提供了新的靶点和方向。

北京时间2022年9月28日晚23时,相关研究发表于《自然》杂志。

图:埃博拉病毒L-VP35聚合酶复合物整体结构

现形:结构稳定的“复制机器”

埃博拉病毒病是由埃博拉病毒引起的烈性急性传染病,主要在人或灵长目动物之间传播。自1976年首次在非洲扎伊尔和苏丹被发现后,埃博拉病毒已在非洲肆虐了近50年,暴发过30多次,造成数万人死亡,病死率最高可达90%。

其中,2014-2016年暴发于西非国家的埃博拉疫情,是有史以来最严重的一次,共导致约2.9万人感染,超过1.1万人死亡。2018至2020年暴发于刚果民主共和国的埃博拉疫情也导致3481人感染,2299人死亡。2021年在西非国家几内亚再次发现埃博拉病毒活跃迹象,提示病毒可能存在潜伏感染。

这些数据说明,对埃博拉病毒仍需加强科学研究。

目前,已有两款上市的扎伊尔型埃博拉病毒抗体药物,其作用靶点是埃博拉病毒表面刺突糖蛋白(GP)。

“已上市的抗体药物具有特异性,不能用于治疗其他类型埃博拉病毒以及马尔堡病毒等丝状病毒。此外,病毒表面的GP蛋白在宿主免疫压力下也容易发生免疫逃逸,有可能造成抗体药物效果变差甚至无效。”论文通讯作者施一对《中国科学报》说。

他表示,由于抗体药物制造成本比较高,需要低温储存,不利于在非洲地区普及推广使用。因此,开发有效安全的广谱性抗病毒小分子药物是应对不同类型埃博拉病毒和其他丝状病毒感染的重要研究方向。

科学家已经发现,埃博拉病毒基因组的转录与复制过程由病毒聚合酶蛋白L和其他辅助蛋白形成的复合物来共同完成。由于聚合酶复合物在不同的丝状病毒中具有高度保守性,是非常理想的广谱性抗病毒药物开发靶点。

此前的研究还发现瑞德西韦和法比拉韦,这两个针对埃博拉病毒聚合酶的核苷类小分子药物具有良好的体外抗病毒活性。然而,其临床效果却并不理想。目前,临床上尚未有批准可用于治疗埃博拉病毒感染的小分子药物。

那么,现有的靶向聚合酶药物如何进行结构优化?能否针对聚合酶保守位点开发新的药物来治疗埃博拉病毒病?

回答这些问题,迫切要求研究人员弄清楚埃博拉病毒的复制机制。

埃博拉病毒属于丝状病毒科,基因组为不分节段的负链RNA,长约19 kb,包含7个开放阅读框。过去近10年,科学家对这种病毒的复杂结构已经有了一些了解,比如它的RNA基因组被核蛋白(NP)包裹,形成核糖核蛋白复合体(RNP),进一步与聚合酶蛋白(L)、病毒辅助蛋白(VP35)、转录激活蛋白(VP30)和核衣壳相关蛋白(VP24)结合,形成螺旋状核衣壳结构,并被基质蛋白(VP40)环绕,进一步与病毒表面GP蛋白形成完整病毒颗粒。

解析埃博拉病毒聚合酶的三维结构却是全球病毒学家面临的一个挑战。经过多年的尝试摸索,施一与高福合作研究团队成功表达纯化获得了埃博拉病毒聚合酶复合物蛋白(L-VP35复合物),并利用冷冻电镜技术解析其高分辨率三维结构。他们发现,埃博拉病毒的聚合酶L蛋白会与VP35蛋白四聚体形成稳定的复合物,进行病毒基因组复制和转录。

那么,L-VP35聚合酶复合物如何介导这一功能呢?研究团队在原子层面对这个问题进行了深入探索。

图:L蛋白与VP35的相互作用细节

入微:揭开“共舞”机制

通过深入观察,研究团队对聚合酶复合物的动态构象变化有了微观水平的了解。

他们发现,作为病毒“复制机器”的核心,聚合酶在生成子代RNA的过程中涉及到多种构象变化,从而促进产物顺利合成,其中最重要的构象变化是从起始态到延伸态的转变。

此前的研究表明,聚合酶从起始状态进入到延伸状态时,酶活中心的两个关键结构元件——启动环(priming loop)和支撑螺旋(supporting helix)必须发生巨大的构象调整,才能保证产物链有足够的空间进行延伸。否则,就会与产物链发生空间位阻。

研究者通过改变冷冻电镜的制样条件,捕捉到了埃博拉病毒聚合酶处于延伸状态时的精细结构。他们发现,在处于延伸构象时,启动环完全缩回到加帽结构域,而支撑螺旋也会远离聚合酶的活性中心,从而为模板/产物双链RNA提供足够的空间进行延伸。

那么,病毒VP35蛋白如何与L聚合酶“共舞”呢?

研究发现,在病毒复制过程中,VP35会像“桥梁”一样,具有连接L蛋白和病毒RNP的功能。“当L聚合酶进行病毒基因组复制时,是以螺旋形的RNP为模板,而不是以裸露的RNA为模板,这时VP35主要行使的是分子伴侣功能,介导L聚合酶以RNP为单元进行复制。”施一向《中国科学报》解释,VP35四聚体除了中间的寡聚化结构域,两头分别有四个N端(氨基端)结构域和四个C端(羧基端)结构域,其中一个C端结合到L蛋白上,进一步稳定L聚合酶与VP35四聚体的结合,同时另外七个端会像“八爪鱼的触角”一样,帮助L聚合酶在RNP结构上发生滑动,以及结合单体状态下的病毒RNP蛋白,阻止其与宿主RNA发生非特异性相互作用,保证单体NP蛋白能够用于子代RNP的生成。

“如果没有VP35,L聚合酶蛋白就没法进行基因组复制和转录过程。”施一表示,如果能够阻断L蛋白和VP35的结合,病毒将无法复制。

图:处于起始和延伸状态时的聚合酶活性中心构象

洞见:指导药物设计与优化

开发能有效抑制埃博拉病毒的小分子药物一直是国际热点,也是难点。

施一表示,了解L-VP35复合物相互作用界面的分子细节,为进一步开发靶向聚合酶的药物提供了新的靶点以及重要指导信息。

据介绍,埃博拉病毒聚合酶活性结构域和加帽结构域与呼吸道合胞病毒(RSV)和狂犬病毒(RABV)等其他(基因组)不分节段的负链RNA病毒聚合酶结构相似,说明这类病毒聚合酶在进化过程中具有保守性。

值得注意的是,研究者指出,埃博拉病毒聚合酶的N端结构域区域具有一个丝状病毒特有的插入结构域,并在埃博拉病毒聚合酶发挥活性时是必不可少的,可成为潜在的抗病毒药物研发靶点。

此次研究中,研究团队还对百年老药苏拉明体外抗埃博拉病毒活性的分子机制进行了探索。

苏拉明是20世纪初由德国化学家保罗·埃利希首次分离出来的一种无嗅、无味的白色粉末,可溶于生理盐水中,后来被发现可用于治疗多种寄生虫病,从20世纪20年代初被广泛用于治疗非洲昏睡病和盘尾丝虫病等寄生虫病。近年来,科学家发现苏拉明具有抗新冠以及癌症活性。前期初步研究提示苏拉明也具有抗埃博拉病毒活性,但其作用机制并不甚清楚。

图:苏拉明药物抑制埃博拉病毒聚合酶的分子机制

研究人员通过体外酶活和细胞复制子实验,发现苏拉明能有效地抑制埃博拉病毒聚合酶活性,并进一步利用冷冻电镜技术解析了埃博拉病毒聚合酶与苏拉明的复合物结构,揭示苏拉明是通过结合在聚合酶的NTP进入通道,阻碍底物进入酶活中心而发挥抑制作用。苏拉明药物与L蛋白相互作用的分子细节,为进一步改造和优化苏拉明药物提供了关键参考信息。

“苏拉明是一种潜在的抗病毒药物,这项研究的一个亮点是解析L蛋白与苏拉明的复合物,这可以指导进一步的抗病毒药物设计。”一位审稿人说。另一位同行评审人则表示,埃博拉病毒L蛋白结构信息的缺乏一直是该领域公认的空白,这项研究提供了重要的信息,有助于促进基于结构的抗病毒药物设计。

原始出处:

Zhu, L., Gao, T., Huang, Y. et al. Ebola virus VP35 hijacks the PKA-CREB1 pathway for replication and pathogenesis by AKIP1 association. Nat Commun 13, 2256 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-29948-4.

作者:冯丽妃

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