浙江大学杜永忠/谈伟强《Adv.Sci.》：细胞外基质水凝胶，可促进糖尿病创面愈合和皮肤再生！

伤口愈合是一项紧迫的临床挑战，尤其是在慢性伤口的情况下。传统的伤口愈合方法由于愈合时间长、免疫排斥反应的风险以及对感染的易感性而限制了治疗效果。近年来，脂肪来源的间充质干细胞来源的外泌体(ADSC-exos)已成为一种很有前途的组织再生和创面修复方式。浙江大学杜永忠教授、谈伟强主任医师和浙江树人大学徐晓玲副教授合作报道了一种新型的细胞外基质水凝胶(ECM@exo)的开发，它将ADSC-exos掺入到细胞外基质水凝胶(ECM水凝胶)中。这种溶液在生理温度(≈37°C)下局部注射到伤口处形成水凝胶。ECM@exo可使ADSC-exos从ECM水凝胶中持续释放，在伤口处保持较高的局部浓度。该ECM水凝胶具有良好的生物相容性和生物降解性。体内外实验结果表明，ECM@exo治疗能有效减轻炎症反应，促进血管生成、胶原沉积、细胞增殖和迁移，从而加速创面愈合过程。总体而言，这一创新的治疗方法为伤口愈合提供了一种新的途径，即通过可控释放外泌体的生物水凝胶。该研究以题为“Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Biopotentiated Extracellular Matrix Hydrogels Accelerate Diabetic Wound Healing and Skin Regeneration”的论文发表在《Advanced Science》上。

该研究构建了一种可注射的温敏性水凝胶，即细胞外基质水凝胶@外泌体(ECM@exo)，它具有外泌体的缓释和良好的生物相容性。以猪左室心肌为原料，经去细胞、消化获得ECM水凝胶，用超速离心法从ADSCs上清液中提取ADSC-exos。然后，将ADSC-exos完全包裹到ECM水凝胶中，制备了ECM@exo。如前所述，一旦注射到伤口部位，ECM@exo溶液就可以在生理温度(近37°C)下形成水凝胶。ADSC-exos从水凝胶中缓慢而持续地释放，以维持伤口处的高浓度。同时，ECM水凝胶在体内逐渐降解。总之，外泌体在伤口愈合中的应用提供了一种有前景的策略，该策略可以有效地减少炎症，促进血管生成、胶原沉积、细胞增殖和迁移，最终加速伤口愈合(方案1)。

方案1. ECM@exo的准备和ECM@exo在伤口愈合过程中的作用

【ADSCs和ADSC-exos的分离与表征】

经过三代培养后，ADSCs呈现出典型的成纤维细胞样外观和塑料黏附特性。四甲基偶氮唑盐比色法显示ADSCs生长正常。ADSCs仍具有向成骨细胞和脂肪细胞分化的能力。透射电子显微镜结果表明，ADSCexos具有典型的碟状结构。这些结果证实了超速离心法成功分离了ADSCs，并从细胞培养上清液中提取了ADSC-exos。

图1. ADSC和ADSC-exo的表征

【温敏性ECM水凝胶的制备与表征】

从猪心肌中成功地脱除了细胞外基质。苏木精-伊红染色和Masson’s三色染色证实细胞几乎完全被去除，近38%的ECM基质由胶原组成。ECM水凝胶在体内自然存在的胶原酶存在下迅速降解。大约95%的ECM水凝胶在72小时后降解。然而，ECM水凝胶腐蚀缓慢。在PBS中放置25天后，在pH=5.5时的腐蚀率接近95%，在pH=7.4时的腐蚀率达到68%，在没有酶的情况下显示出水凝胶的稳定性。且ECM弹性水凝胶网络。更均匀的多孔结构在调节药物释放方面提供了更多的优势。不仅如此，ECM水凝胶还具有良好的细胞相容性。

图2. ECM水凝胶的制备和表征

【外泌体释放与细胞增殖、迁移和管状细胞的形成】

ECM水凝胶具有良好的生物相容性，外泌体从ECM水凝胶中的持续释放可以有效地促进细胞在体外的增殖、迁移和成管活性，从而促进创面愈合。这些结果也提示ECM@exo对创面愈合有潜在的促进作用。

图3. 外泌体释放和ECM@exo的体外评估

【正常创面模型的体内创面愈合评价】

该研究采用正常创面愈合模型和糖尿病创面愈合模型两种全层皮肤创面模型，考察ECM@exo水凝胶的创面愈合能力。结果表明，ECM@exo具有良好的生物相容性，可促进正常创面愈合模型的愈合过程。Masson染色结果提示，ECM@exo作为外泌体缓释系统，可以促进胶原沉积，加速皮肤再生。综上所述，ECM@exo促进了愈合期间细胞的增殖，这可以解释上述肉芽组织的形成和胶原的沉积。

图4. 正常伤口模型的体内伤口愈合评估

血管生成是伤口愈合整个过程中必不可少的一部分。血管可以通过提供祖细胞、氧气和营养物质来促进伤口部位的细胞增殖和基质重塑。免疫组化检测CD31作为内皮细胞的标志物，评价新生血管的形成情况。结果表明，ECM@exo可减轻创面炎症，促进创面愈合。

图5. 正常伤口愈合模型的体内伤口愈合评估

【糖尿病创面模型的体内创面愈合评价】

现今，加速慢性创面愈合的有效治疗方法已成为研究热点。为探讨ECM@exo对糖尿病创面愈合的治疗作用，该研究建立了糖尿病创面模型，并进行了相关实验，以评价其治疗效果。结果表明，ECM@exo可以促进创面愈合，促进细胞增殖，刺激血管生成，减少炎症，从而实现慢性创面高效安全的愈合。

图6.糖尿病伤口模型的体内伤口愈合评估

图7.正常糖尿病伤口模型的体内伤口愈合评估

【小结】

该研究制备了一种负载ADSC-exos的生物ECM水凝胶。ECM@exo具有许多理想的性能，包括热敏性、可注射性、合适的孔结构、可生物降解性、良好的生物相容性、以及创面持续的外泌体释放。ECM@exo可显著促进HaCaT细胞的增殖和迁移，以及体外培养的人脐静脉内皮细胞的血管生成。进一步的体内研究表明，在正常和糖尿病动物模型中，ECM@exo促进了细胞的增殖和迁移、血管生成和胶原沉积，并减少了炎症，促进了伤口的愈合，重塑了皮肤的正常生理结构。这些结果表明，该研究为更有效地治疗正常创面愈合和慢性创面愈合提供了一种新的策略。尽管发现，这项研究的局限性应该被注意到。例如，在伤口愈合和皮肤再生的背景下，准确地确定与外泌体成分相关的特定活动是至关重要的，但该研究并没有完全解决这一问题。展望未来，研究应该集中于阐明这些确切的成分及其对伤口愈合的影响。这样的方法将支持这些发现具有更好的临床应用的潜力。

原文链接：

https://doi.org/10.1002/advs.202304023