IVD前沿丨可高效捕获循环肿瘤细胞新技术

循环肿瘤细胞（CTCs）被认为从原发肿瘤分离并进入血液，直到侵入新的组织部位并产生转移。CTC正在被研究作为癌症早期诊断和预后的生物标志物。受体−配体在细胞膜上的相互作用是非线性的，不遵循经典的钥匙-锁模型。因此，在探针上对配体的空间排列和化学计量学进行编程的能力可以克服CTC捕获中的这些限制。

近日，一组来自中国的研究团队在杂志Nature Protocols上发表了一篇题为“Functionalized tetrahedral DNA frameworks for the capture of circulating tumor cells”的文章。文章描述了DNA -四面体框架偶联的适体“n-simplexes”，可以自行定义空间排列和化学计量，用作特异性靶向细胞膜上受体-配体相互作用的探针。作者描述了针对CTC表面表达的上皮细胞粘附分子的n-simplexes的合成、表征和亲和力测定，并进一步详细介绍了从患者血液样本中捕获CTC的方法。

图片来源：Nature protocols

n-simplexes的设计

n-simplexes是将配体（EpCAM适体）构建在DNA四面体的顶点上。作者将合成TDF的单链 DNA的3’端扩展了15个碱基。扩展片段可与互补的适体杂交，使适体在TDF合成过程中偶联在TDF的顶点上。通过控制TDF顶点上的适体的化学计量（1、2或3），可以构造n-simplexes（0-simplex、1-simplex和2-simplex）。整个合成过程是通过一个退火步骤来完成的，没有任何额外的步骤（如下图）。

n-simplexes的构建。图片来源：Nature protocols

n-simplexes的表征

为了验证n-simplexes的合成，作者使用PAGE电泳来估计合成产率，并通过AFM和透射电镜对配体进行成像。为了在单分子水平上测量n-simplexes适体的化学计量学，作者使用全内反射荧光显微镜（TIRFM）来表征含有Cy3-、Alexa 647-和Alexa488修饰的2-simplex适体。通过逐步单分子荧光光漂白技术可以定量n-simplex适体的精确数量（图c）。

n-simplexes的表征。图片来源：Nature protocols

n-simplexes的结合亲和力比较

为了表征n-simplexes与肿瘤细胞之间的结合亲和力，作者采用竞争试验来比较单个n-simplexes的IC50（图b）。结果显示，IC50值与n-simplexes的效价呈反比。连接到DNA四面体上的适体越多，则IC50越低，表明亲和力越高。

n-simplexes的亲和力测定。图片来源：Nature protocols

n-simplexes捕获肿瘤细胞

作者使用了生物素标记的2-simplexes和链霉亲和素标记的磁珠，利用磁分离技术可以分离与2-simplexes结合的肿瘤细胞。细胞膜上的磁珠可以作为2-simplexes细胞结合能力的一个指标（图b,c）。细胞捕获后可以保持细胞活力，促进其随后的培养和分子分析。作者捕获了具有EpCAM高表达（MCF-7细胞系）和低EpCAM表达（MDA-MB-231细胞系）的肿瘤细胞。n-simplexes对两种细胞系均表现出较高的捕获效率。

n-simplexes捕获肿瘤细胞。图片来源：Nature protocols

n-simplexes应用于临床患者的血液中分离CTC

使用此方法对健康对照、乳腺癌患者的CTC进行定量分析。捕获的CTC数从0~44个CTC/ml不等，表明该方法具有较高的捕获能力。在健康对照、良性和转移性患者中对CTC计数的鉴别显示了此方法在癌症诊断方面的潜力。

从乳腺癌患者样本中捕获CTC。图片来源：Nature protocols

方法的应用

n-simplexes结构可用于各种细胞识别和结合模式。作者已经使用n-simplexes来检测CTC细胞膜上表达的EpCAM受体。也可使用n-simplexes来检测内吞作用或膜粘附。

n-simplexes可以用不同的识别元件进行功能化。通过用其他抗原的适体取代EpCAM适体，n-simplexes可用于捕获其他肿瘤细胞。使用此方法已经从癌症患者的血液中分离出CTC。值得注意的是，此方法可激发由DNA框架编程的各向异性适体的开发，以及设计了基于TDF适体有序纳米界面的微流控芯片，用于肿瘤细胞捕获。作者预计，n-simplexes可以用于检测血液样本和其他生物液体如血清和尿液中的其他生物标志物（如循环外泌体）和病原体。

与其他方法相比

血液中CTC的超低丰度（转移性癌症患者每1×109个血细胞中存在1个）是对CTC捕获的一个技术挑战。传统的微流控分离方法依赖于肿瘤细胞与正常血细胞的不同大小，但表现出有限的分离特异性。为了提高特异性和捕获效率，人们设计了多价探针，以及具有多价适体功能化纳米界面或DNA纳米球的微流控装置已经被测试用于捕获。此外，生物特异性单层抗体涂层已被用于具有高灵敏度的CTC的多价捕获。然而，这些多价策略忽视了细胞表面高度复杂的非线性特性，未能实现所需的空间排列可控性和化学计量学可编程性。

相比之下，n-simplexes中配体空间排列和化学计量学的精确调控模拟了细胞膜上的受体−配体相互作用。利用具有1-3个化学计量学的DNA纳米结构，作者已经能够从癌症患者的血液样本中捕获CTC。

方法的局限性

虽然这种方法是高度灵活的，但它主要受到所需的大量步骤的限制。n-simplexes的制备和表征过程需要11.5小时，从临床样品中捕获CTC和数据处理每六个样品需要约5小时，捕获细胞的下游分析通常需要5.5小时。作者目前正在尝试自动化程序，这将有助于标准化方法。此方法一次只能检测六个样本，不能满足高通量临床样本检测需求。如使用nano plotter和生物芯片扫描仪，能够在24小时内检测~5万个样本，可以大大提高吞吐量。此外，该方法还受到探针的特异性的限制。不表达EpCAM或其他靶向受体的CTC将不会被检测到。为了准确捕获异质CTC，正在考虑基于TDF的混合配体。作者希望在不久的将来集成这些CTC检测设备，将整个过程自动化。