Nat Biotech：青出于蓝，张锋的学生Patrick Hsu发现新型重组酶，将大段DNA高效整合到人类基因组

生命科学的飞速发展，为科学家自由操纵基因提供了前所未有的简便和高效。在分子生物学实验室里，你可以很方便地通过聚合酶链式反应（PCR）将一个基因克隆下来，并连接到相应的表达载体（质粒）上。

遗憾的是，上述的分子克隆实验通常是在原核生物中进行的（例如细菌），但涉及真核生物基因组的操作，特别是几千个核苷酸长度的DNA序列的整合，仍然十分具有挑战性。这也限制了合成生物学、细胞工程和基因治疗等新兴领域的发展。

2022年10月10日，美国弧光研究所（Arc Institute）的 Patrick Hsu 联合斯坦福大学的研究人员，在 Nature Biotechnology 期刊发表了题为：Systematic discovery of recombinases for efficient integration of large DNA sequences into the human genome 的研究论文。

该研究开发了一种算法来识别数千种全新的大丝氨酸重组酶（LSR）及其DNA附着位点，将已知LSR的多样性扩大了100倍。这些LSR可以将超过7kb的大型DNA片段精准、高效地插入人类基因组，为基因组工程化研究以及人类遗传病治疗提供了新的“百宝箱”！

值得一提的是，该论文的第一署名单位弧光研究所（Arc Institute）在去年年底正式成立之时曾轰动世界，该研究所由硅谷科技富豪 Patrick Collison 捐款5亿美元为妻子 Silvana Konermann 成立。

弧光研究所总部

Silvana Konermann 和 Patrick Hsu 是弧光研究所的联合创始人，他们两人都曾是张锋的博士生。2018年3月，二人曾一起发表了一篇 Cell 论文，将小型化的 CRISPR 基因编辑系统 CasRx 用于阿尔茨海默症治疗。

人类遗传病的治疗一直是亟待解决的难题。随着人类基因组学的发展，越来越多人类遗传病基因被相继发现，通过改变遗传病患者的基因序列，从根本上治愈人类遗传病也由此成为了一种很有前景的治疗方法。

导致遗传病的原因有很多，有时候只是编码蛋白的基因上的一个碱基出错了，但有时候可能是一大段基因出现了缺失、重复或重排，这种情况只能通过基因整合的方法将其修复。目前主要依靠DNA双链断裂（DSB）来实现基因整合，例如同源重组（HR），但这种基因编辑手段并不可靠，有时候会导致双链DNA断裂部位附近的碱基缺失，或者产生随机DNA片段插入。

因此，该研究的通讯作者 Patrick Hsu 博士及其团队希望开发一种能够将大片段DNA整合到人类基因组中的分子工具，且不需要产生DNA双链断裂，也不需要依靠细胞的DNA修复机制。

Patrick Hsu（右）是张锋（左）的第一届研究生

基于假定的新工具的特点，研究团队将目光聚焦于天然存在于噬菌体中的可移动遗传元件——大丝氨酸重组酶（LSR）。

大丝氨酸重组酶（LSR）是噬菌体携带的一种整合酶，它们通过识别细菌基因组和噬菌体DNA片段上的特定序列，将大片段DNA序列整合到细菌的基因组中。这种机制使位点特异性大片段DNA插入成为可能，而不需要任何细胞辅助因子，也不会产生有害的DNA双链断裂（DSB）。

在这项最新研究中，研究团队设计了一种算法来检索不同种类的噬菌体中可能存在的LSR序列，经过粗略筛选后，他们发现了6207种具有序列特异性的LSRs。这将已知的LSRs数目扩展超过100倍。

新型LSR的系统发现和分类

紧接着，研究团队合成并测试了超过60种不同的新发现LSR，其中最高效的新型LSR大大优于其他重组酶。例如，与此前常用的Bxb1相比，新型LSR的质粒重组效率要高7倍，基因组插入效率为40-75%，插入的DNA片段大小超过7kb。

新型LSR具有很高的插入重组效率

基于这些关键特性，研究团队将收集到的新型LSR分类为着陆垫型、基因组靶向型或多靶向型，并指向三种不同的应用：1）在基因组着陆区（landing pad）上安装扩增文库的新方法；2）大片段DNA的基因组整合和同一细胞内多个区域的同时整合；3）直接靶向人类基因组的特定位点。

着陆垫型LSR

不仅如此，研究团队还展示了新型LSR可以在无病毒载体递送的情况下，直接整合质粒或扩增子文库到基因组上，显示了它们在改进功能基因组学应用研究中的强大潜力。此外，研究团队还指出，这些LSRs可以用于CAR-T细胞的生产，与目前使用慢病毒介导的转基因递送相比，LSRs可以将目标基因整合到特定位点，极大地避免了慢病毒介导转基因递送的随机性。

特异性人类基因组靶向重组酶的发现

总而言之，这项研究通过算法检索到数千种新型LSR，并对其中60多种LSR进行了功能验证，表明这些新型LSR具有更高的重组效率，且最大可以插入超过7kb的DNA大片段，为基因编辑的工具箱又增添了一种新工具，为人类遗传病治疗开辟了新道路。

原始出处：

Durrant， M.G.， Fanton， A.， Tycko， J. et al. Systematic discovery of recombinases for efficient integration of large DNA sequences into the human genome. Nat Biotechnol (2022). https：//doi.org/10.1038/s41587-022-01494-w.