王华楠教授/刘佳副研究员《Biomaterials》: 局部递送具有蛋白/多酚自组装保护层的干细胞球治疗心肌梗死

心力衰竭是一种全球常见的疾病，占全世界死亡人数的三分之一。心肌梗死(Myocardial infarction, MI)是导致心力衰竭的最常见急性心脏损伤形式。干细胞疗法对于许多心脏损伤患者是一种创新的治疗策略，过去的实验研究和若干临床试验证明了干细胞治疗的安全性和可行性。但也存在诸多问题，比如干细胞治疗的挑战：低细胞保留和移植率。近年来，研究者开发了多种提高细胞保留的方法。但是还存在问题：1）移植的细胞会被免疫反应识别和清除；2）梗死区pH降低、基质金属蛋白酶含量升高和活性氧(ROS)过剩，可导致移植细胞凋亡；3）梗死区缺乏细胞外基质微环境基础、血供不足和缺氧等结果不能支持细胞生存。

近期大连理工大学王华楠教授团队等人提出了一种基于间充质干细胞(MSC)球体的心肌梗死治疗策略，通过在细胞球表面引入蛋白质/多酚自组装防护层的方法，提出了一种基于间充质干细胞（MSC）球的心肌梗死治疗策略，该策略通过主动调控病理性MI微环境，显著增强了治疗效果，并具备多功能性包括保护供体细胞免受宿主免疫清除延长MSC在MI部位的停留，重塑ROS微环境以及刺激MSC的促愈合旁分泌。此外，防护层可通过诱导缺氧改变干细胞的代谢方式，从而增强MSC免疫调节和血管生成能力。最后，局部递送涂层MSC球在MI大鼠中显著缓解了局部炎症和纤维化，介导巨噬细胞极化向促愈合的M2表型，并改善心脏功能。总的来说，这项研究为设计功能性生物材料增强干细胞免疫调节治疗MI开辟新的途径。相关工作以“Local delivery of stem cell spheroids with protein/polyphenol self-assembling armor to improve myocardial infarction treatment via immunoprotection and immunoregulation”为题发表在Biomaterials。

【文章要点】

首先，设计并制备了多微孔PDMS芯片，用来制造大量干细胞球体。为了保护细胞免受损伤部位有害微环境的影响，我们利用天然细胞外基质(ECM)蛋白和多酚表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，通过层层自组装，在细胞球体上设计了一层聚合物涂层。纤维蛋白原(Fg)可以提供与间充质干细胞整合素受体相互作用的先天细胞粘附部分。EGCG被引入作为蛋白质的交联剂，同时也作为ROS清除剂。利用蛋白质氨基残基与多酚的酚羟基和苯环基团之间的疏氢和疏水相互作用，在细胞球表面涂覆Fg/EGCG保护层（图1）。

其次，体外验证Fg/EGCG保护层对ROS和免疫清除的保护作用。移植同种异体干细胞治疗损伤心肌组织通常面临不利的微环境，包括炎症反应引起的累积氧化应激和蛋白水解酶，以及宿主免疫细胞募集。这些因素会对移植细胞造成不可逆的损伤，影响治疗效果。在体外模拟ROS微环境证实包被的细胞保持较高的活性；通过干细胞球体与NK-92细胞共培养研究了涂层对宿主免疫清除的屏蔽作用。此外，心肌梗死的炎症微环境伴随着大量蛋白水解酶的存在。因此，采用胰蛋白酶作为模型蛋白水解酶，验证涂层对被包裹细胞球抵抗蛋白酶攻击的保护作用。实验结果表明，干细胞球体上的Fg/EGCG涂层不影响细胞的活力，且作为一个物理屏障，保护细胞免受MI病理环境（ROS、蛋白水解酶和宿主免疫细胞）的影响（图2）。

再次，体外验证Fg/EGCG保护层对心肌细胞的保护作用以及巨噬细胞极化的免疫调节作用。结果表明，在炎症模拟条件下，Fg/ EGCG包被的干细胞球可以保护CMs免受细胞损伤；可以抑制M1巨噬细胞活性，促进ROS微环境中M1向M2巨噬细胞极化，证明通过免疫调节治疗炎症相关疾病的有效性。为了探索干细胞球体如何发挥这些治疗功能的潜在机制，通过RNA-seq分析Fg/EGCG保护层中干细胞的转录组。研究阐明了具有Fg/EGCG涂层不仅对供体细胞具有免疫保护作用，而且通过缺氧触发MSCs的糖酵解，进而增强干细胞促进血管生成和免疫调节的旁分泌功能，提高干细胞治疗效率（图3）。

最后，体内验证具有Fg/EGCG保护层的干细胞球对心肌梗死的疗效。结果证实了具有Fg/EGCG保护层的干细胞球在心肌梗死部位停留时间延长，显著改善心脏组织的结构和功能（图4）。进一步研究Fg/EGCG保护层的干细胞球在MI病理微环境中不同阶段的功能，我们评估了早期(第4天)病变部位的中性粒细胞浸润和巨噬细胞极化，以及后期(第28天)的血管生成功能。结果表明，Fg/EGCG保护层的干细胞球在体内显著增强了对中性粒细胞的抑制作用，促进向M2巨噬细胞的极化，促进了梗死心脏的血管生成（图5）。

【结论与展望】

心肌梗死是威胁人类生命健康的主要疾病之一，心肌梗死时心肌组织缺氧、血供减少，最终导致心肌细胞坏死。其破坏性后果包括引发早发性炎症以及心脏组织纤维化、瘢痕形成甚至心力衰竭的长期影响。由于心肌梗死的病理生态位环境复杂，单纯通过局部移植或静脉注射干细胞治疗可能无法达到预期的治疗效果。为此，本文提出了一种生物材料+干细胞策略，将功能性生物材料与干细胞结合，保护供体细胞免受宿主免疫清除、重塑病理微环境以及刺激MSC的促愈合旁分泌。功能性生物材料重新配置MSCs从氧化代谢到糖酵解代谢的代谢途径，从而协调炎症抑制和血管生成的促愈合级联，最终改善了梗死心脏组织的修复。

该研究得到了国家重点研发计划项目、国家自然科学基金项目、深圳市科技创新委员会项目、龙岗市医药卫生科技专项项目、医院与学校联合基金项目、中央高校基本科研业务费专项资金的支持。

图1 Fg/EGCG保护层的制备及参数优化

图2  Fg/EGCG保护层对ROS和免疫清除的保护作用

图3 Fg/ EGCG包被干细胞球的转录组学研究

图4 干细胞移植后心肌梗死组织结构及功能的评价

图5 干细胞移植心肌梗死组织免疫细胞和血管生成的免疫组织学分析

原文链接：

https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0142961224000607