Nature：基于长读长测序的等位基因特异性分析揭示人类组织转录组变异

RNA剪接导致的转录结构变化以及5 '和3 '非翻译区（UTRs）的差异是基因调控的一个关键特征。转录结构的破坏在人类疾病中起着重要作用，与剪接变化相关的遗传变异涉及常见疾病及许多严重的孟德尔病。通过转录比率数量性状位点（trQTL）和剪接数量性状位点（sQTL）分析可以绘制出影响转录组结构的常见遗传变异，进一步表明影响基因表达水平和剪接的遗传变异往往是不同的。

用于分析遗传调控效应的正交方法——等位基因特异性表达（ASE）分析，已被证明是研究罕见遗传变异的一种高度敏感方法。目前，长读长RNA测序技术已经被用于研究转录组结构和新转录足，以及早期等位基因特异性分析。因此，通过长读长转录组数据进行等位基因特异性转录结构（AST）分析，可以提供关于罕见和常见变异如何影响转录结构和疾病风险的重要信息。

近日，来自美国纽约哥伦比亚大学的研究团队通过长读长等位基因特异性分析来了解罕见和常见变异对转录组的遗传影响。该研究结果发表Nature上，文章题为“Transcriptome variation in human tissues revealed by long-read sequencing”。

文章发表在Nature上

研究团队利用ONT平台，对GTEx项目的细胞系和人体组织的88个样本进行了长读长RNA-seq。分析显示，长读长测序数据的基因和转录组定量与Illumina RNA-seq高度一致。低相关性基因和转录组在ONT数据中表达较低，复杂性较高的基因和转录组包含多个外显子。（图1）研究团队分析了一些相关性较低的基因阅读覆盖率，例如PRELID1，ONT捕捉得更好；ARSB，ONT测序显示3 '偏倚。

图1.数据集概述和质量控制。

研究团队使用FLAIR31量化了转录组并识别新转录组。更多的新转录组在注释转录组数量高的基因中被发现（图2），87%内含子保留事件为新发现，表明虽然已进行了poly（a）富集步骤，但pre-mRNA仍然存在。另一方面，只有37%的外显子跳过事件是新发现的，表明它们在现有的注释中得到了更好的表达。

图2.新转录本的发现和组织间的比较。

接下来，为了解决由相关位点附近的测序错误导致的局部比对偏差，研究团队开发了一个比对框架，并为每个供体创建了两个单倍型特异性参考。为了进行ASE和AST分析，研究团队对比了一个转录组相对于同一基因的其他转录组（图3），研究团队开发了一个新的软件包LORALS（长读长等位基因分析）。除了采用以前为短读长测序数据开发的可映射性和基因分型错误过滤器，研究团队还引入了处理长读长测序数据较高错误率的标记，并使用模拟数据进行了功率计算，以测试reads、转录组数量和效应大小如何影响AST检测能力。

图3.长读长测序数据的等位基因分析。

最后，研究团队评估了用新颖的转录注释和来自长读长测序的AST数据更好地解释罕见变异的潜力。评估结果显示，产生最严重后果的变异占所有变异的0.75%，其中编码变异为16435个。研究发现，与保留相同注释的变体相比，重新分配给更严重后果的变体平均具有更高的CADD得分（图4）。被重新分配为致病性变异的结果表明，该研究检测出了以前可能被遗漏的部分生物学和功能性变异。因此，研究团队重新注释了ClinVar变体，最终9582个变体重新分配（1.23%）。研究发现，不确定的良性或致病性临床意义且没有认定标准的变异被重新分配的比例最高（4%和3.1%）。

图4.通过新发现转录组和AST分析的变体解释。

综上所述，研究团队开发了一个新的计算软件包LORALS，通过长读长测序等位基因特异性分析来研究罕见和常见变异对转录组的遗传影响。研究团队描述了等位基因特异性表达和转录本结构事件，为常见和罕见基因变异引起的特定转录组改变提供了新的见解。以上结果加强了人们对转录组分析重要性的认识，即不是从基因或不精确定义的剪接水平上分析，而是对特定转录本的详细描述。

参考资料：

Glinos, D.A., Garborcauskas, G., Hoffman, P. et al. Transcriptome variation in human tissues revealed by long-read sequencing. Nature 608, 353–359 (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05035-y

https://www.nature.com/articles/s41586-022-05035-y