去泛素化酶：小分子药物研发的新机遇

前言

去泛素化酶广泛参与细胞增殖、自噬、DNA损伤修复以及免疫应答等各种生理过程，与肿瘤、阿尔兹海默等多种疾病的发生发展息息相关。

去泛素化酶不仅可以调控可成药蛋白，还能调节传统靶向治疗不敏感或难以用小分子干预的蛋白水平，是一类极具潜力的药物靶点。

目前去泛素化酶小分子抑制剂尚处于早期开发阶段，有2个分子正在进行临床I期试验，药物研发的难点在于开发准确有效的生化分析方法、筛选技术以及提高对同族蛋白的选择性。

01去泛素化酶数量众多

广泛参与细胞生命活动调控

泛素化（Ubiquitination）是一种翻译后修饰，通过泛素连接酶催化的级联反应，将泛素分子C末端的羧基共价连接到底物蛋白N末端或赖氨酸的氨基上，底物泛素化后可改变其功能、定位、稳定性以及蛋白-蛋白相互作用。

去泛素化（Deubiquitination）则是和泛素化相反的过程，在去泛素化酶（Deubiquitinases，DUBs）的催化下，底物蛋白上的泛素分子被去除，从而免于被蛋白酶体降解。抑制去泛素化酶能够导致蛋白选择性降解，并可能影响其他“不可成药”靶点。因此，DUBs是有潜力的药物靶点。

图1，泛素化/去泛素化系统

人体中约有100种不同的去泛素化酶，根据结构的不同可分为泛素特异性蛋白酶(ubiquitin-specific proteases,USPs)、泛素羧基末端水解酶(UCHs)、卵巢肿瘤蛋白酶(OTUs) 、Machado-Joseph病蛋白结构域蛋白酶(MJDs)、JAMM/MPN区域相关金属肽酶(JAMMs)、含锌指的泛素肽酶1 (ZUP1)以及motif与泛素相互作用的新DUB家族(MINDYs)等7个家族。其中，结构、功能研究最为深入，小分子抑制剂报导最多的是USP家族。图2，去泛素化酶的分类

02去泛素化酶(USBs)的作用机制

DUBs在发挥催化作用时，首先通过S1口袋识别泛素上的疏水性Ile44 patch，以及His72和His74残基，从而将泛素要断裂的肽键定位到DUB的催化位点，而近端的S1’口袋则决定了底物蛋白的特异性，可以将连有相同泛素的不同底物蛋白区分开来。DUBs的催化口袋一般由半胱氨酸、组氨酸以及天冬氨酸组成，其中带巯基的半胱氨酸的-SH对泛素和底物蛋白之间的肽键连接链发起亲核进攻，使其断裂；催化口袋不含半胱氨酸的JAMM家族则通过锌原子的诱导来使肽键断裂。

DUBs通过其催化作用，可以特异性地将泛素从被泛素标记的底物蛋白上解离出来，维持游离泛素水平，与此同时将底物蛋白从泛素降解途径中释放出来，防止其被降解。图3，去泛素化酶的催化机制

03DUBs与多种疾病相关

是有潜力的药物开发靶点

研究表明，DUBs在恶性肿瘤、神经退行性疾病和其他一些免疫性疾病的发生发展中扮演了重要角色，此外，部分细菌、病毒如COVID-19也通过表达病原性的DUBs来抑制宿主的免疫反应，以增加生存和复制几率。

DUBs在多个层面上和肿瘤发生发展有关，包括但不限于调控关键表观遗传变化、调节癌基因/肿瘤抑制蛋白活性、调节DNA损伤修复等。例如，USP7可以将E3泛素连接酶MDM2去泛素化，提高MDM2在细胞中的水平，而MDM2则会将抑癌因子p53泛素化，抑制p53介导的细胞周期阻滞和凋亡，为肿瘤的发生发展创造条件。另外，USP7还可去泛素化PTEN蛋白和转录因子FOXP3，从而促进肿瘤的生长和转移。

在帕金森病（PD）、阿尔兹海默症（AD）等神经退行性疾病中，与疾病相关的神经纤维缠结、路易体以及线粒体稳态等，受到泛素化和去泛素化系统的调控，促进致病蛋白/损伤线粒体的泛素化，即抑制相关DUBs的活性，可起到治疗疾病的效果。研究表明，损伤线粒体的积累将导致细胞代谢缺陷，与PD发生相关，去泛素化酶USP30被认为可以阻止损伤线粒体的自噬，从而引起损伤线粒体积累，因此，抑制USP30的功能将有利于治疗PD和其他线粒体疾病，这一猜想已在动物模型中得到验证。USP14则被认为可以减少PD的α-突触核蛋白和AD中的Tau蛋白的泛素化，抑制USP14的功能也将有助于疾病的治疗。图4，在多种疾病中扮演重要角色的去泛素化酶

04DUBs小分子抑制剂开发

处于早期阶段，挑战与机遇并存

目前已有较多DUB的小分子抑制剂报导，大致可分为泛素类似物、催化抑制剂、变构抑制剂3类，开发方法一般是通过基于DUBs的高通量筛选、表型筛选以及基于NMR的片段筛选，获取合适的hit，然后进行对hit进行优化，以提高其活性和成药性。

由于DUBs与疾病关联的生物学机制尚未完全解析、家族成员多且结构保守等原因，DUBs抑制剂的开发相较激酶、膜受体等类型靶点则更具挑战。但同时DUBs也可以调节传统靶向治疗不敏感或不受直接抑制的蛋白水平，其中可能包括“不可成药”的靶点，例如转录因子、耐药酶和蛋白质相互作用中难以直接用小分子干预的蛋白。

截至2022年10月，有3个DUBs小分子抑制剂进入到临床I期试验中，其中1个已被终止开发，尚未有药物获批。其余报导的小分子抑制剂则均处于临床前研究中，其中超过一半的小分子为多靶点的抑制剂，参与研发的公司包括诺华、罗氏、Mission Therapeutics、KSQ Therapeutics等公司。

①VLX1570由Vivolux公司开发，是第一个进入临床试验的DUBs抑制剂，可同时抑制USP14和UCHL15，用于多发性骨髓瘤的治疗，但由于严重的剂量限制毒性引起患者死亡导致临床试验终止。

②KSQ-4279由KSQ Therapeutics研发，为USP1的变构抑制剂，对其他USP成员的选择性很高，目前处于晚期实体瘤的I期临床试验中。

③Mission Therapeutics公司开发的MTX652是USP30的选择性抑制剂，可以促进损伤线粒体的降解，用于治疗慢性肾病，已于今年4月开启临床I期试验。此外，还有超过60个小分子处在临床前研究阶段。图5，部分已报导的DUBs抑制剂结构

总结

DUBs广泛参与细胞内的各种生理过程，包括转录、凋亡、自噬、DNA修复、免疫应答等，其功能失调与阿尔兹海默症、肿瘤等多种疾病息息相关，是一类极富市场潜力的药物靶点。

DUBs小分子抑制剂已在临床前研究中表现出不俗疗效，未来还需进一步提升其对同家族成员的选择性，以精准制导相关疾病通路，提升药物的安全性。虽然尚未有产品获批，但DUBs生物学调控机制和结构功能学的研究正在一步步深入，PDB上已披露了超过10个DUBs和小分子的共晶结构，为DUBs抑制剂的开发提供了坚实的基础。

我们有理由相信，在不远的将来，安全有效的DUB抑制剂也将获得监管机构批准，为多种疾病患者提供更多治疗选择。