脑脊液vs血浆，非小细胞肺癌脑转移患者基因检测选哪种样本，突变检出情况分别如何？

脑转移（BM），包括脑实质转移（BPM）和软脑膜转移（LM），是晚期癌症患者的毁灭性并发症。NGS正成为一种新的有前途的癌症突变检测手段，可以促进癌症的诊断。本回顾性研究纳入了进行NGS检测的非小细胞肺癌（NSCLC）合并 BPM 和 LM 患者，分析了分子遗传学特征。收集了 37 例 NSCLC-BM 患者的脑脊液（CSF）样本和配对血浆样本。比较了NSCLC-BM患者CSF循环肿瘤DNA（ctDNA）、血浆ctDNA和原发肿瘤组织样本的NGS检测结果，分析了基因突变特征。在37例NSCLC-BM患者中，28例患者存在LM伴或不伴BPM，9例患者仅存在BPM。在NSCLC-LM患者中，原发肿瘤检出的驱动突变和耐药突变包括：EGFR L858R（10，35.7%）、EGFR 19del（6，21.4%）、EGFR L858R+MET（1，3.6%）、EGFR L858R+S768I（1，3.6%）、ALK（2，7.1%）、ROS1（1，3.6%）、阴性（5，17.9%）和未知（2，7.1%）。在NSCLC-LM患者中，CSF ctDNA的检出率和丰度显著高于配对血浆 ctDNA。在NSCLC-LM患者中，CSF ctDNA检出的主要驱动突变和其他独特突变与原发肿瘤保持高度一致。BPM 患者的 CSF ctDNA 检测结果为阴性。BMP 患者的 EGFR 19del 频率高于 L858R 突变（55.6% vs 11.1.%），而 LM 患者的 EGFR L858R 频率高于 19del 突变（50.0% vs 25.0%）。血浆ctDNA阳性患者大多为男性（p = 0.058）且处于不稳定状态（p = 0.003）。本研究表明，CSF ctDNA NGS检测可能反映NSCLC-LM的分子特征和异质性。NSCLC患者及时检测CSF ctDNA，特别是对于血浆ctDNA检出突变的患者，可能有助于早期发现LM。EGFR 19del 患者发生 BPM 的风险可能更高。

研究背景

脑转移（BM），包括脑实质转移（BPM）和软脑膜转移（LM），是晚期癌症患者的毁灭性并发症。肺癌是脑转移的主要原因。晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者通常表现为转移性疾病，包括 64.5% 发生 BPM 和 35.5% 发生 LM。表皮生长因子受体（EGFR）突变见于 9.4% 的 NSCLC 患者。BPM 最常见发生于大脑半球，其次是小脑和脑干。LM 定义为癌细胞播散到软脑膜、蛛网膜下腔和其他具有脑脊液（CSF）的腔室，通常会导致严重的神经系统疾病。LM 的诊断通常依赖于增强磁共振成像（MRI）和CSF细胞学检查。值得注意的是，CSF细胞学检查是诊断 LM 的金标准。CSF细胞学评估具有高度特异性，但灵敏度中等，首次检测阳性率为 50%。MRI 的灵敏度有限，尚未确定。现有的BM治疗选择主要包括放疗、全身化疗、靶向治疗、鞘内化疗和免疫检查点抑制剂，其中靶向治疗可以改善携带敏感突变的NSCLC-BM患者的预后和生活质量。然而，NSCLC-BM患者的预后仍然较差，BPM患者的中位总生存期（OS）为36.3个月，LM患者为26.4个月。

NSCLC-BM患者进行基因检测对于精确诊断和精准治疗至关重要。然而，获取脑组织是困难的，这阻碍了我们对BM分子状态的了解。随着液体活检的发展，通过下一代测序（NGS）检测血浆和CSF循环肿瘤DNA（ctDNA）在指导NSCLC-LM的治疗中发挥着越来越重要的作用。对于转移性和/或复发性疾病，液体活检相对于组织活检的优势是无创、可重复，有可能全面了解疾病的分子组成，克服空间和时间异质性。然而，血浆ctDNA水平并不能完全反映BM患者的基因突变。先前的一项研究表明，CSF ctDNA NGS 检测的灵敏度高于血浆 ctDNA，能够更好地反映 LM 患者的分子特征。本回顾性研究纳入了进行ctDNA NGS检测的非小细胞肺癌合并BPM和LM患者，探索了其分子遗传学特征。

研究结果

纳入了河北医科大学第四医院神经内科2019年3月至2022年9月期间的28例NSCLC-LM患者和9例NSCLC-BPM患者。纳入标准如下：（1）原发肿瘤经病理学或细胞学证实为NSCLC；（2）根据2017 ESMO指南，证实LM，包括 1）明确的肿瘤病史，2）新的神经系统体征，3）典型的影像学表现，4）在CSF细胞学检查中发现癌细胞；（3）BPM的诊断标准基于脑MRI阳性结果；（4）对CSF、血浆和/或组织样本进行了NGS检测。排除标准如下：（1）CSF和血浆ctDNA未配对，（2）同时存在原发性脑或脊髓肿瘤（图1）。

图1

NSCLC-BM患者的基线特征

在37例NSCLC患者中，28例存在LM伴或不伴BPM，9例患者仅存在BPM。在 28 例 LM 患者中，14 例（50.0%）为女性，中位年龄为 57 岁（范围：34-74 岁）。LM 在基线（n = 3，10.7%）或治疗过程中（n = 25，89.3%）被诊断，中位间隔为 19.0（1.0–70.0）个月。NGS检测结果显示，LM患者原发肿瘤的主要驱动突变包括EGFR L858R（10，35.7%）、EGFR 19del（6，21.4%）、EGFR L858R+MET扩增（1，3.6%）、EGFR L858R+S768I（1，3.6%）、ALK（2，7.1%）、ROS1（1，3.6%）、阴性（5，17.9%）和未知（2，7.1%）（图2A）。LM诊断时的ECOG PS评分如下：0（1，3.6%），1（10，35.7%），2（10，35.7%），3（6，21.4%），4（1，3.6%）。在 28 例患者中，18 例（64.3%）在 LM 初始诊断时存在 BPM。22例患者（78.6%）存在颅外疾病。BPM 状态如下：PD（12，42.9%），SD（6，21.4%），无 BPM（10，35.7%）。颅外疾病状态如下：PD（11，39.3%），SD（11，39.3%），无颅外疾病（n=6，21.4%）。大多数（23/28，82.1%）驱动突变患者有靶向治疗史，并在疾病进展时改用不同的靶向药物（表1）。

图2

表1

NSCLC-LM中CSF ctDNA的灵敏度高于血浆ctDNA

结果表明，在LM患者的突变检测中，CSF ctDNA的灵敏度高于血浆ctDNA。所有CSF ctDNA均为阳性，而血浆ctDNA中13/28（46.4%）为阳性（图2B）。CSF检出的主要驱动和耐药突变包括EGFR L858R（12，42.9%）、EGFR 19del（6，21.4%）、EGFR L858R+S768I+ROS1（1，3.6%）、EGFR L858R+T790M（1，3.6%）、EGFR 19del+MET扩增（1，3.6%）、ALK（2，7.1%）、ROS1（1，3.6%）、KRAS（2，7.1%）、EGFR G719S+E709A+MET扩增（1，3.6%）和EGFR G719C+L861Q+MET扩增（1，3.6%）（表2，图2C）。血浆检出的突变包括EGFR L858R（5，17.9%）、EGFR 19del（4，14.3%）、EGFR L858R + T790M（1，3.6%）、EGFR L858R + T790M + C797S（1，3.6%）、EGFR 19del + KRAS（1，3.6%）、EGFR G719C + L861Q（1，3.6%）和阴性（15，53.6%）（表2，图2D）。CSF ctDNA的检出率和类型高于配对血浆样本。CSF与配对血浆之间主要突变的一致性为32.1%（9/28）。血浆ctDNA驱动突变阳性患者大多为男性（M：F = 9：4），其颅外疾病状态更可能处于进展阶段（8/13，61.5%）（图3A）。相反，血浆驱动突变阴性患者大多为女性（M：F = 5：10），其颅外疾病状态更可能处于稳定期/无颅外疾病（13/15，86.7%）（图3A）。此外，76.9%（10/13）的血浆ctDNA阳性NSCLC-LM患者存在BPM，而血浆ctDNA阴性患者这一比例为53.3%（8/15）（表1，图3B）。CSF ctDNA的丰度显著高于血浆ctDNA，除了1例患者（P24）血浆样本驱动突变丰度高于CSF样本，该患者在LM初始诊断时发生颅外疾病进展，出现新的骨转移（表1，图4A）。

表2

图3

图4

NSCLC-LM中CSF和血浆ctDNA与原发肿瘤驱动突变的一致性

在NSCLC-LM患者中，CSF ctDNA样本检出的主要驱动突变与原发肿瘤高度一致。CSF样本突变与原发肿瘤突变的一致性更高。在21例原发肿瘤驱动突变阳性患者中，19例（90.5%）患者CSF检出驱动突变。在2例原发肿瘤驱动突变阴性患者中，CSF检出EGFR突变，包括患者7检出19del突变（28个月后检出L858R突变）和患者25检出L858R+MET扩增（67个月后检出G719S+E709A+MET扩增）。在这 21 例患者中，10 例（47.6%）血浆样本驱动突变阳性（表1、2）。

在 28 例 NSCLC-LM 患者中，5 例患者对肿瘤组织样本和配对CSF 样本进行了NGS检测，两种样本类型之间高度一致。5 例患者原发肿瘤驱动突变阴性、CSF样本驱动突变阳性，其中只有2例患者配对血浆样本驱动突变阳性。1例患者耐药突变（MET）在CSF中检测到，但在肿瘤组织中未检测到（表2）。

NSCLC-LM的基因图谱

图4B展示了28例NSCLC-LM患者CSF和配对血浆样本的基因图谱。在EGFR基因中观察到主要驱动突变。CSF和血浆样本之间的罕见突变存在部分差异。CSF检出的平均突变数为4.9（范围0-12）。突变频率最高的基因为TP53（17，60.7%）、EGFR L858R（14，42.9%）、EGFR 19del（7，21.4%）、ARID1A（3，10.7%）、CDKN2A（3，10.7%）、MET（3，10.7%）、RUNX1（3，10.7%）、ALK（2，7.1%）、ROS1（2，7.1%）、CHD8（2，7.1%）、HDAC9（2，7.1%）、KRAS（2，7.1%）、POLD1（2，7.1%）、EPHA3（2，7.1%）、RECQL4（2，7.1%）、BRIP1（2，7.1%）和RB1（2，7.1%）（图4B，C）。血浆检出的平均突变数为2.3（范围0-12）。突变频率最高的基因为TP53（8，28.6%）、EGFR L858R（7，25.0%）、EGFR 19del（5，17.9%）、EGFR T790M（2，7.1%）、DNMT3A（2，7.1%）和NF1（2，7.1%）（图4B，C）。在2个血浆样本（P3和P13）和1个CSF样本（P9）中检测到EGFR T790M突变。所有患者在检测前均接受第一代EGFR-酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）治疗。在接受第三代 EGFR-TKI 治疗的 3 个 CSF 样本（P6、P12 和 P25）中检测到 MET 扩增。此外，在CSF样本中还检测到一些罕见的共突变，包括EGFR G719C+L861Q+MET扩增（1，3.6%）、EGFR G719S+E709A+MET扩增（1，3.6%）和EGFR L858R+S768I + ROS1（1，3.6%）。在血浆样本中检测到EGFR L858R + C797S + T790M（1，3.6%）（表2，图4B）。

NSCLC-BPM的CSF和血浆ctDNA检测结果

在9例BPM患者中，原发肿瘤驱动突变NGS检测结果如下：EGFR突变（5，55.6%）[包括19del（4，44.4%）]、L858R+A871E+MET（1，11.1%）、ALK（1，11.1%）、ROS1（1，11.1%）、KRAS（1，11.1%）和未知（1，11.1%）。7 例患者进行了CSF ctDNA 检测，所有患者结果均为阴性。在 5 例初始诊断为 BPM 的患者中，4 例患者进行了肿瘤组织和配对血浆检测，其中 2 例患者表现出一致性（2/4，50.0%）。在4例在病程中被诊断为BPM的患者中，3例患者存在基因突变，其中1例患者驱动突变在血浆ctDNA和原发肿瘤组织中一致（1/3，33.3%），而T790M耐药突变仅在血浆中检测到。值得注意的是，虽然在BPM中血浆ctDNA可能有用，可作为组织检测的补充，但不能替代组织检测（表3）。

表3

讨 论

在本研究中，从NSCLC诊断到BM的中位间隔为18.0（0.0-70.0）个月。在某些特定人群中，如间变性淋巴瘤激酶（ALK）阳性 NSCLC 患者，BM 发生率可高达 80%。这对亚洲人来说尤为重要，据报道，亚洲人的EGFR突变发生率为63%，远高于其他人群。在本研究中，BM中最常见的驱动突变是EGFR突变（23/37，62.2%），包括L858R（13/37，35.1%）和19del（10/37，27.1%），这与先前的研究结果一致。

在肿瘤患者中，基因突变检测对于精准医疗很重要。随着液体活检和测序方法的发展，血浆和CSF ctDNA NGS检测在指导NSCLC-BM的治疗中发挥着越来越重要的作用。先前的研究表明，CSF ctDNA 可以反映 BM 的分子特征和异质性，包括 BPM。在本研究中，LM 患者的 CSF ctDNA 阳性率较高，而 BPM 患者的 CSF ctDNA 阳性率较低（所有检测患者均为阴性）。之前的一项研究表明，BPM 患者的CSF突变检出率较低，可能是因为肿瘤距离产生CSF的脑室较远。癌细胞可能通过四个主要入口进入软脑膜间隙：通过脉络丛的动脉循环、通过Batson静脉丛的静脉循环、沿脊髓和颅神经的直接侵犯，以及通过细胞界膜的实质疾病侵犯。

肿瘤细胞转移到大脑的过程涉及一系列步骤，包括从原发部位分离、侵犯周围组织和血管、血液传播、穿透血脑屏障（BBB）和脑克隆生长。在本研究中，BPM 患者 CSF ctDNA 阴性可能是因为肿瘤细胞尚未穿透 BBB。在某种程度上，CSF ctDNA结合影像学表现可能有助于临床医生确定BPM和/或LM患者是否需要鞘内化疗。如果条件允许，我们建议BPM患者应同时进行CSF ctDNA、血浆ctDNA和肿瘤组织检测，以进行综合评估和治疗。需要进一步研究其他灵敏的生物标志物和先进的BMP检测方法。

CSF ctDNA 水平可反映 NSCLC-LM 患者的分子特征和异质性，作为 LM 诊断的补充。在本研究中，NSCLC-LM 患者CSF突变谱与原发肿瘤的高度一致（90.5%），与先前的研究结果一致。在CSF中也检测到许多其他突变，反映了肿瘤的异质性。这一结果表明，CSF ctDNA是一种可靠的生物标志物，可以指导NSCLC-LM的治疗。特别是，当肿瘤组织不可及时，血浆 ctDNA 是得到最广泛研究和使用的基因检测方法，在很大程度上反映原发性肿瘤和颅外疾病。

TKI 药物用了较长时间后，肿瘤细胞出现新的突变，或者非主要突变变成主要突变，从而导致耐药性。在本研究中，LM患者的驱动突变包括EGFR L858R（12，42.9%）、19del（6，21.4%）、ALK（2，7.1%）和ROS1（2，7.1%），这些是临床上的主要药物靶点。推荐 LM 患者使用 BBB 穿透能力强的第三代 TKI 药物，即使没有 T790M 突变。在本研究中，最常见的耐药突变为EGFR T790M（3/28，10.7%）和MET扩增（3/28，10.7%）。先前的一项研究表明，应用第一代和第二代 EGFR-TKI 药物后，产生的主要耐药机制是EGFR T790M 突变，在血浆中容易检测到。在本研究中，3 例患者 EGFR T790M 突变阳性，其中 2 例在血浆样本中检测到，1 例在CSF样本中检测到。所有3例患者均接受了第一代TKIs治疗。奥希替尼已被批准用于携带EGFR T790M突变的患者，适用于LM治疗。MET扩增是另一种TKI获得性耐药机制。在对第一代、第二代和第三代 EGFR-TKI 产生耐药性的 EGFR 敏感突变 NSCLC 患者中，5%-20% 的患者存在获得性 MET 扩增。在本研究中，3例接受第三代 TKI 治疗的患者检出 MET 扩增，均在 CSF 中检测到。在既往 EGFR-TKI 治疗后出现疾病进展并同时存在 EGFR 突变和 MET 扩增的 NSCLC 患者中，尤其是对于 MET 扩增水平较高的患者，EGFR-TKI 和 MET-TKI 联合治疗仍然有效。

本研究还观察到 EGFR G719C、G719S、L861Q、S768I 和 C797S。先前的研究表明，在EGFR突变NSCLC患者中，罕见EGFR突变的发生率约为20%。G719X 和 L861Q 是主要的罕见突变，与 EGFR-TKI 疗效较好相关，而位于外显子 20 的 S768I 突变与对 EGFR-TKI 缺乏敏感性有关。C797S和T790M共突变是奥希替尼耐药的一个原因。既往的一项研究表明，罕见突变患者的预后明显不如常见突变（包括 L858R 和 19del 突变）患者。阿法替尼是一种第二代 EGFR-TKI，似乎能够以足够的浓度穿透 CNS，从而对 CNS 转移产生临床作用，可能是针对这些罕见 EGFR 突变的最佳 EGFR-TKI。此外，大多数不携带耐药基因的LM患者也出现疾病进展，提示存在其他耐药机制或当前检测方法的局限性。在本研究中，许多 LM 患者携带 TP53（17/28，60.7%）突变。TP53 是一种抑癌基因，TP53突变预测预后不良。到目前为止，TP53 突变是不可成药的。

KRAS突变被认为是肺癌的关键驱动因素，其中KRAS p.G12C占KRAS突变的45%-50%。在本研究中，3例NSCLC-LM患者携带KRAS突变，均为p.G12V突变（3/28，10.7%），其中2例在CSF中检出，1例在血浆中检出。尽管最近开发了一些靶向 KRAS p.G12C 突变的药物，但大多数 KRAS 癌蛋白仍不可成药。

大多数（68.1%）晚期 NSCLC 患者有 BPM 合并症。然而，只有32.4%的患者同时被诊断为LM和晚期NSCLC。大多数 NSCLC 患者在治疗过程中发生 LM，这被认为是晚期 NSCLC 中比 BPM 晚的事件。此外，与 BPM 相比，LM 患者更可能出现多发性转移（≥ 2 个转移部位），并且生存时间更短。

癌症容易出现并发症。在黑色素瘤、NSCLC、小细胞肺癌和乳腺癌中， BPM 和 LM 都有可能发生。肾癌常转移至脑实质。相比之下，淋巴瘤和白血病通常引起LM。小细胞肺癌、肺腺癌和NSCLC患者在诊断时脑转移的发生率 >10%。乳腺癌、肾癌和黑色素瘤患者中分别只有 0.4%、1.5% 和 0.7% 在诊断时发生脑转移。

这些现象背后的机制尚不清楚，但它们可能是不同肿瘤中分子变异的临床表现。EGFR L858R NSCLC 患者比 EGFR 19del 患者更可能发生 LM。Takano 等人的 BPM 研究显示，EGFR L858R 突变转移灶相比 19del 转移灶更可能发生于实质（尾状核、小脑和颞叶），并且相比 19del 或 EGFR 野生型转移灶更靠近大脑表面。

然而，样本量有限，只有 9 例 BMP 患者，无法全面比较 BPM 和 LM 的特征。在本研究中，55.6%（5/9）的 BMP 患者携带 EGFR 19del 突变，只有 11.1%（1/9）的 BMP 患者携带 L858R 突变。相比之下，50.0%（14/28）的 LM 患者携带 EGFR L858R突变，25.0%（7/28）的 LM 患者携带 EGFR 19del 突变。Li 等人报道了类似的结果， EGFR 19del  NSCLC 患者比 EGFR L858R 突变患者更可能发生 BMP。

我们还发现，NSCLS-LM患者的颅外疾病存在性别差异。血浆ctDNA驱动突变阳性患者大多为男性（M：F = 9：4），并且更可能处于进展阶段（8/13，61.5%），提示男性患者的肿瘤负荷较高（表1，2，图3A）。越来越多的证据表明，男性的肺癌发病率高于女性；此外，男性患者的预后比女性患者差。女性NSCLC患者通常为非吸烟者，且EGFR突变阳性。EGFR在亚洲NSCLC患者中的发生率特别高。女性患者更好的结局可能是因为其可以接受EGFR TKIs治疗，这与临床实践一致。

此外，在血浆ctDNA阳性LM患者中，与阴性患者相比，颅外疾病更有可能处于进展阶段，61.5%（8/13）vs 13.3%（2/15）（表1，2，图3A），提示血浆ctDNA是预后因素。这可能是因为较高的肿瘤负荷导致较高的血浆ctDNA水平。我们的结果表明，血浆 ctDNA 是 NSCLC-LM 患者的预后因素。

据我们所知，比较 NSCLC-LM 和 NSCLC-BPM 患者 NGS 癌症相关基因谱的研究较少。Li等人比较了中国东南部四川省NSCLC-LM和NSCLC-BPM患者的特征，包括EGFR突变、BPM或LM的发病时间、多发转移比例和生存状况。他们发现NSCLC-LM患者和NSCLC-BPM患者在病变位置和EGFR突变亚型方面存在显著差异。本研究包括来自中国北部河北省的患者。这两项研究代表了中国人群的特征。应该在其他种族，如高加索人和非洲人中进行进一步的研究，以确定这是否是一种普遍现象。

本研究存在局限性。本研究为单中心回顾性研究，样本量相对较小，病例选择基于CSF和配对血浆NGS，在病例选择上存在不可避免的偏倚。因此，未来需要多中心、前瞻性大样本研究来验证本研究结果。

本研究表明，在NSCLC-LM患者中，CSF ctDNA检出的主要驱动突变以及其他独特的分子特征与原发肿瘤保持高度一致。CSF ctDNA NGS检测可能反映NSCLC-LM的分子特征和异质性。NSCLC患者及时检测CSF ctDNA，特别是对于血浆ctDNA检出突变的患者，可能有助于早期发现LM。EGFR 19del 患者发生 BPM 的风险可能更高。

参考文献：

Liu X, Mei F, Fang M, Jia Y, Zhou Y, Li C, Tian P, Lu C, Li G. Cerebrospinal fluid ctDNA testing shows an advantage over plasma ctDNA testing in advanced non-small cell lung cancer patients with brain metastases. Front Oncol. 2024 Jan 10;13:1322635. doi: 10.3389/fonc.2023.1322635. PMID: 38269023; PMCID: PMC10806520.