读书报告 | 晚期黑色素瘤出现多种进化途径

导读

虽然黑色素瘤药物治疗已有革命性进步，晚期黑色素瘤仍然是致命性疾病。了解黑色素瘤转移和免疫检查点抑制剂（ICB）耐药的进化途径对于改善晚期黑色素瘤患者的生存结局至关重要。本文作为PEACE研究尸检计划的一部分，展示了迄今为止最全面的患者内转移性黑色素瘤的数据集，包括来自14例接受ICB治疗的患者的222个外显子组测序、493个面板测序、161个RNA-seq和22个单细胞全基因组测序样本，并观察到频繁的全基因组倍增和广泛的杂合子丢失，其通常涉及抗原呈递机制。研究的部分发现：

1）KIT染色体外DNA可能导致KIT驱动基因阳性的黑色素瘤患者对KIT抑制剂无应答。

2）MYC扩增在ICB无应答者中富集，因此，MYC可能是预测转移性黑色素瘤患者发生ICB耐药的潜在生物标志物。

3）单细胞测序提示患者存在不同克隆的转移瘤形成多克隆种植。

4）脑转移的特征是较早发生克隆分化但相对于其他转移部位而言较晚出现脑转移。

上述结果提示，晚期黑色素瘤通过多种不同途径进化，这可能是困扰黑色素瘤后线治疗的原因。本文通过尸检研究和转移灶的密集采样，结合广泛的多组学分析，阐明了黑色素瘤逃避治疗和免疫系统发挥作用的多项机制，为设计黑色素瘤后线治疗提供参考（Cancer Discov.2023 Jun 2;13(6):1364-1385. doi: 10.1158/2159-8290.CD-22-1427）。

立论依据

据报道，接受PD-1/CTLA-4联合治疗的晚期黑色素瘤患者5年OS率为52%。

当前的研究更侧重于队列规模，但是非多肿瘤分析本身并不能充分了解从治疗耐药进展到患者死亡的潜在进化轨迹。因此，有必要将这些研究与深入采样、分析相结合。

尸检已成为克服活体肿瘤采样局限性的方法之一，然而，各种领域仍未被探索，如通过转录组学和放射学数据分析的基因型与表型的联系等等。

在泛癌背景下，全基因组倍增（WGD）与不良预后相关。此外，在WGD肿瘤中，镜像亚克隆等位基因失衡（MSAI）增加，这表明拷贝数变化和持续的染色体不稳定的平行进化。然而，疾病进展到晚期的过程有多需要WGD和染色体不稳定性仍不清楚。

因此，对14名晚期黑色素瘤患者尸检时进行了广泛的多区域和多肿瘤取样（573个肿瘤样本），并使用外显子组、转录组和高深度面板测序数据，放射学以及单细胞全基因组测序数据进行深入分析。

技术路线

队列概述

• 患者特征：治疗的中位线数为2.5；所有患者均接受ICIs治疗，9/14名患者接受PD-1+CTLA4；8/14患者接受MAPK，1/14患者接受两种KIT抑制剂；3/14患者接受了TMZ/DTIC+铂类化疗。

• 共有来自14例患者（PEACE研究中的皮肤、肢端、粘膜和原发灶不明的黑色素瘤）的387个肿瘤的573个样本（涵盖尸检时采集的N和T组织，重点是对每例患者的转移灶全面采样），检测方法：基因面板分析（493）、WES（222）、RNA-seq（161）、单细胞全基因组测序（22）。

• A：皮肤型TMB为2.44~156 Muts/Mb，MUP为8.47~111 Muts/Mb，肢端型为1.11~6.79 Muts/Mb，而粘膜型6170为2.18Muts/Mb，与先前的报告一致，反映不同亚型之间的诱变暴露水平不同，特别是紫外线和化疗。

• A：11/14例病例中检测到WGD，涵盖所有亚型，并在4例中观察到克隆性WGD，通过结合突变时间表明WGD具有选择性优势。

B：在WGD和染色体拷贝数增加的背景下，加权基因组不稳定性指数显著升高，由拷贝数损失驱动 

C：复发性LOH克隆区域富集于抑癌基因，包括10/14的9p（CDKN2A）、9/14的10q（PTEN）和6/14的6q（ARID1B）；8/14患者有8p的克隆性LOH，但选择性驱动因素尚不清楚；等位基因失衡（AI）常见，亚克隆AI在WGD样本中富集；在基因水平，最常见的SCNA是BRAF扩增，见于14例患者中的12例（7例为克隆性，5例为亚克隆性），尚有2例无激活性BRAF突变的病例

肿瘤突变特征与进化史

皮肤型中除了一名肛周原发患者（2986）外，大多数克隆性突变都归因于突变Signature，与紫外线暴露有关。Signature在所有MUP病例中也占主导地位，表明其源于暴露于阳光的原发灶，随后消退。肢端和粘膜型的主要特征是Signature 1A（与年龄相关）。 

基于WES发现的SNVs和小插入缺失（indels），观察到不同的系统发育结构：

• 6553、9359和2378（绿线）遵循线性进化轨迹，没有分支和亚克隆，其转移灶种植模式是单克隆的（所有转移灶都由同一单克隆种植）。

• 2986、9097、1599、1614、5107和1047（红线）具有分支系统发育和多个亚克隆（7~13）特征，克隆数量与亚型无关。

TMB与亚型和化疗暴露相关

• 3例患者接受化疗（TMZ/DTIC+DDP），2/3（1599和5107，化疗C5）的亚克隆TMB增加，其特征是与TMZ暴露相关的Signature 11；接受化疗的第三例患者（6170）中未观察到该Signature，可能是由于暴露时间短得多。

• 基于SCNA的树与SNVs的系统发育一致，但在线性SNV（6553、9359和2378）的病例中，树显示了SCNA驱动的亚克隆分化。

晚期脑转移瘤的特征

A：脑转移灶的SCNAs负荷（wGII）最低

B：脑转移的克隆通常在SNV和SCNA树的早期分化，早期进化与晚期临床出现脑转移相关性在不同患者中是一致的；脑转移克隆由于SCNAs负荷较低而适应性较差，导致后来出现可检测到的转移

C：接受DDP+DTIC C6治疗的患者5107对这一假设提供了进一步支持

D-F：化疗突变Signature仅在脑转移中缺失，脑转移的特征是较早发生克隆分化以及相对于其他转移部位出现较晚

黑色素瘤通过突变和拷贝数机制对治疗产生耐药性

观察到MAPK通路重新激活的多种耐药机制：NRAS突变（1047、5107）、不同亚克隆NRAS突变（5107的Q61H和G13R）的平行进化以及MAP2K1突变（2567）

A：1例KIT突变型（克隆性V650A）在KIT编码位点出现了极端克隆性拷贝数扩增，相应KIT表达水平升高

B：代表性转移灶的单细胞测序显示：细胞水平的KIT拷贝数为43～134，并且在染色体外DNA （ecDNA） 

C：在单细胞假体中观察到ecDNA

D：通过FISH验证，并在该病例中观察到大量KIT拷贝与DAPI染色的核DNA共定位

B：对单细胞水平SCNAs进行分层聚类，观察到ecDNA随机分离的证据，这与广泛的拷贝数范围一致，此外，该患者连续接受了两种KIT抑制剂，药物靶点染色体外扩增可能导致对其无应答

E：所有患者均接受ICI治疗并出现原发性/获得性耐药，并且在死亡和肿瘤取样时均为ICI难治性：

• ICI耐药的已知驱动因素发生了改变，包括12例患者JAK2 LOH和8例患者的B2M LOH以及6746中的JAK1（p.S961L）和B2M（p.R101P）的克隆突变。

• HLA杂合性缺失水平（5%为亚克隆性）与先前报道相似（3%为亚克隆性），并且在编码HLA基因的区域中没有LOH的富集。

• 根据抗原呈递机制改变对肿瘤进行的分层聚类表明，肿瘤在很大程度上是根据患者而不是根据部位聚类。

识别影响病灶特异性应答的因素

ICI应答包括混合应答，其中一些肿瘤消退，另一些肿瘤进展，患者内部和患者之间的不同克隆进化轨迹：

• A：WGD状态的差异

• B：wGII随着WGD的增加而显著增加

假设：不同病灶对治疗的位点水平应答可能因病变的遗传构成（无论是基因型还是拷贝数改变）而异

将基于RECIST标准的放射学缓解数据与每个肿瘤的面板测序数据匹配，产生了包含7例患者的32个肿瘤的可用数据集，进行了一项基于置换的GIS-TIC检测，从而在有/无应答的病灶中，找到拷贝数发生显著改变的区域

C/D：包含COSMIC基因RSPO2、EIF3E、CSMD3、RAD21、EXT1、MYC、NDRG1和FAM135B的染色体8q的拷贝数增加与病灶水平无应答显著相关

MYC可能是转移性黑色素瘤ICI耐药的标志物

D：在对ICI有应答的病灶中，1号染色体上的一个局灶区域显著扩增。同样地，9p21位点包含显著的肿瘤抑制因子CDKN2A、MTAP以及一簇IFN基因，并且在泛肿瘤研究中与ICI耐药相关

BRAF、PTEN和TP53的拷贝数改变与病变水平应答之间的关联均不显著

研究单细胞分辨率下的拷贝数变化

A/B：CRUKP2567是例外，因为膈肌转移瘤中较低的倍体群体反映了恶性细胞，这表明它们的高wGII值

C：对该患者的批量测序拷贝数树进一步检查显示，导致大多数转移的分支存在WGD，但在原发肿瘤或脑转移灶中则未检出

在膈转移的单细胞拷贝数谱中，观察到7n细胞（来自高倍性群体）和4n~5n细胞（来自低倍性群体），表明在膈肌转移瘤中两种克隆共存，即一个WGD克隆和一个非WGD克隆

D: 对该患者的批量样本和单细胞拷贝数谱进行分层聚类，结果树得到一致结果

研究单细胞分辨率下的拷贝数变化

E：CRUKP2567的临床病程，在IV期诊断时，该患者有广泛的胸腔病灶，随后BRAF和MEK抑制剂联合治疗后达到颅外CR，随后对靶向治疗耐药的胸部疾病迅速再次出现。治疗前的胸腔积液样本存在WGD，提示WGD前后均存在克隆。而在他的膈肌转移瘤中存在两个不同WGD状态的克隆，提示低倍体的非WGD克隆可能来源于非WGD预处理群体，并且在获得性耐药后WGD克隆在该位点再生。

小结

本文展示了迄今为止最全面的患者内转移性黑色素瘤数据集，作为PEACE研究尸检计划的一部分，包括来自14名接受ICI治疗的患者的222个外显子组、493个面板测序、161个RNA-seq和22个单细胞全基因组测序样本。

脑转移的特征是较早发生克隆分化以及相对于其他转移部位出现较晚。

KIT染色体外DNA可能是导致KIT驱动的黑色素瘤对KIT抑制剂缺乏反应的原因。

MYC可能是转移性黑色素瘤ICI耐药的标志物。