中国科学院遗传发育所戴建武团队《自然·通讯》：单细胞测序解析神经再生胶原支架促进灵长类脊髓损伤修复机制

脊髓损伤修复是世界再生医学难题。研究表明，脊髓损伤后，缺血缺氧、免疫反应、自由基释放等一系列病理反应导致损伤区神经细胞死亡，轴突和髓鞘分解，神经传导功能破坏，同时在损伤部位形成抑制再生微环境，致使感觉、运动功能难以恢复。目前研究者对脊髓损伤区的病理过程已经有一定的了解，但是对损伤以下不同区域的细胞动态及异质性反应仍缺乏深入了解。中国科学院遗传发育所戴建武团队20年来专注脊髓损伤修复研究，成功研发了神经再生胶原支架（NeuroRegen Scaffold）。经过8年100余例患者的临床研究，表明神经再生胶原支架修复脊髓损伤安全有效。但支架材料促进脊髓损伤修复的机制，特别是对损伤区和损伤以下区域的作用机制，有待进一步阐明。因此，解析脊髓损伤后不同区域详细的细胞动态以及进一步阐明功能性支架材料对损伤区和损伤以下区域的修复机制，对于开发脊髓损伤修复策略具有重要意义。

2023年8月9日，中国科学院遗传发育所戴建武团队在Nature Communications上发表了题为Single-cell analysis reveals region-heterogeneous responses in rhesus monkey spinal cord with complete injury的文章，以灵长类动物恒河猴为研究对象，通过单细胞转录组测序深入解析恒河猴完全性脊髓损伤近端和远端不同区域的细胞动态变化，并阐明胶原材料支架移植对完全性脊髓损伤不同区域的治疗效应和机制。

本研究中，研究人员建立胸段全横断脊髓损伤恒河猴模型，根据病理特点将恒河猴损伤脊髓分为损伤区(Injured area, IA)，退变区(Degenerative area, DA)和激活区(Spared but activated area, SA)。然后分别对这几个损伤近端区域及损伤以下远端腰段(Spared lumbar, SL)正常组织在不同时间点(7天，14天，30天，6个月)进行单细胞测序，最终获得涵盖已知全部细胞类型的恒河猴脊髓损伤单细胞图谱。通过对不同区域的细胞组成分析，获悉了不同区域详细的细胞组成动态(图1)。

图1. 恒河猴脊髓损伤单细胞图谱揭示区域相关细胞动态

为了进一步了解详细的细胞异质性特征及其动态变化，研究人员对恒河猴脊髓损伤不同位置的小胶质细胞，神经元，少突胶质细胞等进行重点分析。发现脊髓损伤后小胶质细胞持续激活产生一群疾病相关小胶质细胞 (DAMLM)。特别是在远端SL区域，DAMLM比例持续增加，几乎和损伤近端相同。同时，DAMLM下调小胶质稳态相关基因，上调脂代谢和吞噬相关基因，并低表达促炎性M1相关基因，主要分布在下行神经纤维(如皮质脊髓束)区域，负责清除退变细胞碎片(图2)。损伤后近端和远端神经元呈现不同的病理反应，近端兴奋性神经元比例增加，而远端腰段抑制性神经元比例增加。损伤近端神经元在急性期显著上调再生相关基因，而远端神经元则在慢性期上调自噬相关基因(图3)。成熟少突胶质细胞 (OLs) 在损伤近端和远端均诱导出现新的亚群，产生SERPINA3⁺疾病相关亚群（DOLs），主要分布在下行神经纤维区域，并且相对于正常OLs细胞，DOLs显著下调髓鞘化相关基因表达。同时，远端腰段的小胶质细胞，神经元和少突胶质细胞上调表达RNA剪切、饥饿响应及自噬相关基因，表明远端组织细胞长期处于应激状态(图4)。

图2. 小胶质细胞激活诱导为疾病相关样小胶质细胞(DAMLM)。

图3. 损伤以下近端和远端组织神经元的异质性反应

图4. 疾病相关少突胶质细胞特征

在此基础上，研究团队分析了神经再生胶原支架材料联合抗肿瘤药物西妥昔单抗共同移植对恒河猴脊髓损伤的修复作用及机制。通过对损伤区组织进行分析，发现支架移植能明显促进损伤区神经纤维再生，促进施旺细胞及血管周成纤维细胞向损伤区迁移，促进损伤区细胞神经营养因子表达，并且减少胶质瘢痕成分蛋白沉积（图5）。同时，通过对远端腰段组织分析，发现支架材料移植减少神经元细胞中抑制性神经元比例，同时减少炎症性小胶质细胞的比例，促进DAMLM小胶质细胞的吞噬和脂代谢功能，促进OLs髓鞘化相关基因表达（图6-7）。这提示支架材料移植不仅能改善损伤区微环境还能调控远端脊髓组织退行性微环境，最终促进损伤修复。

图5. 支架材料移植促进轴突再生并改善损伤区微环境

图6. 支架材料移植挽救远端腰段组织神经元功能

图7. 支架材料移植修复远端腰段组织微环境

综上所述，研究人员利用单细胞测序技术建立了恒河猴脊髓损伤单细胞图谱，并利用神经再生胶原支架进行脊髓损伤恒河猴移植治疗，不仅首次全面解析灵长类脊髓损伤区域异质性病理过程，而且首次阐明支架材料治疗脊髓损伤对远端退行性微环境的调控机制。为了解灵长类的脊髓损伤病理过程及开发脊髓损伤修复治疗策略提供理论依据。

中国科学院遗传发育所戴建武研究员，赵燕南青年研究员，肖志峰副研究员为该论文的共同通讯作者，博士研究生范永恒，吴宪明副研究员和华南农业大学韩素芳副教授为本论文共同第一作者。该工作受到自然基金委重大项目和中国科学院先导等项目的资助。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-023-40513-5