刘昌胜院士/袁媛教授/张琰教授AM：通过多层次活性氧调控水凝胶，促进老化骨修复！

衰老会在多个层面上加剧组织再生功能障碍，并逐渐降低个体承受压力、损伤和疾病的能力。活性氧(ROS)的过度积累被认为是衰老干细胞的一个标志特征，它会引起氧化应激，恶化宿主微环境，并最终成为老年骨缺损修复的关键障碍。目前，这些策略还不能同步、彻底地调控衰老细胞的细胞内和细胞外ROS。在此，华东理工大学刘昌胜、袁媛教授、张琰教授通过制造含有雷帕霉素负载的聚二硒化物的可注射聚乙二醇化聚(甘油癸二酸酯)(PEGS-NH₂)/聚(γ-谷氨酸)(γ-PGA)水凝胶，开发了一种用于老化骨再生的多层次ROS清除系统-碳酸盐)纳米胶束(PSeR)。这种PSeR水凝胶对局部老化微环境表现出高度敏感的ROS响应，并动态释放载药纳米胶束以清除衰老骨间充质干细胞中积累的细胞内ROS。PSeR水凝胶通过保护氧化环境中的DNA复制，有效调节骨间充质干细胞的抗氧化功能并延缓衰老，从而促进自我更新能力，增强体外和体内老化骨修复的成骨能力。因此，这种多层次ROS调节水凝胶为治疗退行性疾病提供了一种新策略。该研究以题为“Rejuvenating Aged Bone Repair Through Multihierarchy Reaction Oxygen Species-Regulated Hydrogel”的论文发表在《Advanced Materials》上。

作为概念验证，该研究开发了一种聚乙二醇化的聚庚二酸甘油酯(PEGS-NH₂)/聚(γ-谷氨酸)(γ-PGA)水凝胶(PEGS-PGA)，并负载了含有雷帕霉素(R)的聚(二硒碳酸酯)纳米胶束(Se)(方案1)。联硒化物表现出高度敏感的ROS响应性，*10+，使其成为应对复杂的老化再生环境的合适候选者。因此，我们设计了一种两亲性聚合物mPEG-BP(TMC-co-MSeSe)，它可以自组装成纳米胶束(Se)，并作为inROS的强效清除剂和药物(雷帕霉素)的载体。R在细胞内的释放诱导衰老细胞的自噬活动，促进受损线粒体的消除并阻止ROS的产生，还通过mTOR途径抑制细胞衰老。此外，R具有诱导BMP/Smad途径激活的能力，从而促进干细胞的成骨分化。为了在老年骨缺损中为丝氨酸纳米胶束提供稳定的环境，设计了聚乙二醇PGA(P)水凝胶来负载丝氨酸并维持exROS。P水凝胶可以很容易地注射到骨缺损处，并可以实现原位交联，以促进老年骨再生。P水凝胶为长期再生提供了理想的手术操作和机械支持，骨架上丰富的羧基(-COOH)通过有效的铁离子络合物的形成防止·OH的产生，从而清除exROS。体外实验表明，多层ROS调节水凝胶的抗氧化能力增强，并通过清除ROS使衰老的BMSCs恢复功能。此外，该研究通过干预PSeR水凝胶对具有挑战性股骨缺损的老年小鼠进行干预，证实了更好的骨再生结果。

方案1. 老年骨再生多级活性氧(ROS)清除系统示意图

【具有ROS反应能力的聚二硒化碳酸酯纳米胶束的制备及表征】

衰老细胞中功能失调的线粒体积累导致ROS持续产生，导致衰老骨髓间充质干细胞的功能受损。为了降低衰老BMSCs的inROS水平，使用甲氧基聚乙二醇(mPEG)，通过酶催化开环聚合合成了共聚物mPEG-b-P(TMC-co-MSeSe)作为大引发剂。当在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中负载疏水性雷帕霉素(Rapa)时，合成的mPEG-b-P(TMC-co-MSeSe)三嵌段共聚物可以很容易地自组装成球形且均匀的SeSe纳米胶束。这些 SeSe/Rapa (SeR)纳米胶束表现出 5.933% 的高载药效率和78.337%的包封效率。即使在低H₂O₂浓度(10 μM)下，SeR胶束对ROS也具有高敏感性和响应性，从而为多层次ROS调节奠定了基础。

图 1. 具有ROS清除能力的SeR纳米胶束的制备和表征

【负载SeR纳米胶束(PSeR)的可注射PEGS-PGA水凝胶的制备和表征】

为了调节exROS并使SeR纳米胶束适应老化骨再生，该研究开发了一种具有高浓度羧基的可注射PEGS水凝胶组以促进SeR纳米胶束的局部管理。PEGS-PGA水凝胶是通过氨基功能化聚乙二醇癸二酸酯(PEGS-NH₂)和聚(γ-谷氨酸)(γ-PGA)交联形成的。SeR纳米胶束在交联前与PEGS前体混合。注射后，PEGS-NH₂和γ-PGA之间建立了化学交联网络，该化学交联网络由偶联剂1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐 (EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(N-羟基琥珀酰亚胺)活化和催化。此外，PSeR水凝胶表现出卓越的可注射性，不会阻碍针头，快速形成针对复杂缺陷的特定形态(<60 s)。PSeR水凝胶表现出良好的组织粘附力，确保骨缺损周围稳定粘附。

除了PSeR水凝胶对老化骨再生的临床意义外，还评估了它们对ROS的反应以及它们在老化微环境中清除ROS的能力。利用芬顿反应研究了复合水凝胶对exROS的响应性和清除能力，该反应可以产生与老化微环境中类似的羟基自由基(·OH)。P水凝胶可以有效去除液体环境中的Fe²⁺。掺入PEGS-PGA降低了SeSe纳米胶束对ROS环境的响应性，延长了药物释放时间，使其更适合治疗目的。然而，PEGS-PGA的存在并不妨碍衰老BMSCs对SeR胶束的内化，从而为Rapa在细胞内发挥其作用提供了平台。

图 2. 负载SeR纳米胶束(PSeR)的可注射PEGS-PGA水凝胶的制备和表征

【PSeR水凝胶的体外抗氧化性能增强】

该研究使用DCFH-DA荧光探针研究了inROS水平和细胞内抗氧化特性。流式细胞术结果进一步证实复合水凝胶可以有效去除衰老BMSCs中过量的inROS。这些发现表明，PSeR 水凝胶可有效恢复衰老BMSCs的细胞内和细胞外氧化水平。为了更深入地了解PSeR水凝胶对衰老BMSCs抗氧化能力的影响，通过JC-1荧光染色评估了线粒体功能。结果表明PSeR 水凝胶可能会增强对通过上调抗氧化基因来抑制衰老BMSCs的氧化损伤。此外，R可以通过促进体外自噬有效改善细胞衰老并增强衰老BMSCs的成骨潜力，并且在Se负载后观察到更明显的效果。

P水凝胶、Se胶束和R共同在不同水平上调节衰老BMSCs的微环境，将衰老BMSCs的内在抗氧化能力提高到年轻BMSCs的水平。随着受损线粒体的消除，衰老BMSCs中过多的 ROS产生受到抑制。经过多ROS调控，阐明了衰老干细胞功能恢复的底层逻辑。PSeR通过中断涉及线粒体功能障碍、ROS 过量产生和抗氧化剂降解的恶性循环，为衰老干细胞创造更有利的“呼吸”环境。

图3. PSeR水凝胶调节衰老BMSCs细胞内和细胞外ROS水平，提高衰老BMSCs的体外抗氧化能力

【PSeR水凝胶可减轻BMSCs的衰老并增强体外成骨潜力】

衰老细胞的积累是阻碍老年人组织再生的主要原因。通过PSeR水凝胶促进的多层次ROS调节，评估了负责骨再生的BMSCs中的细胞衰老程度。结果表明ROS水平对BMSCs的命运具有显着影响，并强调调节ROS可以延缓细胞衰老并部分恢复再生功能。该研究已成功恢复衰老BMSCs的细胞内和细胞外氧化水平，使其与年轻细胞相似，但这些细胞的功能恢复仍然有限。假设ROS的调节不能从表观遗传学上完全逆转细胞衰老，但增强这一过程可以为衰老细胞的再生创造更有利的环境。

图4. PSeR水凝胶通过体外干预衰老来改善衰老干细胞的功能

为了进一步揭示PSeR干预BMSC衰老的潜在机制，收集经过PSeR处理(S处理)后的衰老BMSCs进行生物信息学分析。结果表明，PSeR水凝胶处理增强了S BMSCs的DNA复制能力，表明其作为持续性DNA损伤抑制剂的潜力。总之，ROS的多层次调节干扰了BMSCs的衰老，并通过改善衰老BMSCs的DNA损伤来改善细胞增殖。因此，PSeR通过干扰细胞衰老来促进衰老骨再生可能具有潜在的临床应用价值。

图 5. PSeR治疗减弱衰老BMSCs中年龄相关通路的表达

【PSeR水凝胶促进衰老小鼠BMSCs的功能恢复和成骨作用】

衰老骨组织中骨髓间充质干细胞数量的减少和细胞衰老会导致骨组织稳态的丧失和再生潜力的衰减。为了研究PSeR水凝胶对体内衰老BMSCs清除ROS的调节作用，在老年小鼠(20个月)中建立股骨远端缺损模型，并在植入后3天分析水凝胶内的细胞和组织。结果表明，多层次ROS调节系统能够通过清除ROS来有效地使体内衰老的BMSCs恢复活力，从而恢复其老化骨再生的成骨潜力。尽管R组中衰老BMSC的存在率较低，但ROS调节的增强仍然有限；因此，PSeR水凝胶的利用在改善老化骨再生的微环境方面具有更大的优势。体内结果表明，在没有干预的情况下，衰老骨缺损部位的BMSCs中，衰老的BMSCs占<30%，这表明对非衰老BMSCs的再生功能有显着的负面影响。先前的研究表明，衰老疗法可以通过消除衰老细胞来有益于组织再生，而该研究表明，衰老细胞具有被“修饰”并提供再生能力的潜力。

图 6. PSeR水凝胶通过调节老化骨缺损中的ROS水平，促进体内衰老BMSCs的功能恢复

随后，该研究测试了具有多级ROS调节的PSeR水凝胶是否可以改善患有远端股骨缺损的老年小鼠的骨再生。研究结果表明，ROS的多层次调节增强了老年骨缺损的再生微环境，加速了愈合过程。

图 7. PSeR水凝胶的促成骨功效在体内进行了评估

【小结】

衰老引起的活性氧(ROS)水平失衡是损害老化骨组织再生的主要因素。在这项研究中，通过组装可注射的聚(γ-谷氨酸)交联的氨基官能化聚(癸二酸甘油酯)水凝胶，开发了一种多层次ROS清除系统，该水凝胶含有负载雷帕霉素(PSeR)的聚(二硒化物-碳酸酯)纳米胶束。研究结果表明，这种创新系统有效地消除了细胞内ROS的积累，并在整个老化骨修复过程中维持了有利的细胞外氧化环境。此外，通过ROS的多层次调控，成功地通过靶向细胞周期和DNA复制来干预骨髓间充质干细胞(BMSC)衰老。体内研究进一步证实了PSeR在增强老化骨组织再生方面的功效。相信这项研究提出了一种通过ROS清除材料的设计来恢复衰老骨骼再生的新策略，并为促进退行性相关疾病治疗的治疗概念提供了宝贵的见解。

原文链接：

https://doi.org/10.1002/adma.202306552