Nature Immunology综述 | 利用空间技术解码肿瘤微环境

肿瘤微环境（TME）是由多种细胞类型和细胞外成分组成的复杂动态生态系统。系统解析TME的细胞异质性和空间结构，是研究肿瘤进展和治疗反应潜在机制的关键。近年来，单细胞技术在很大程度上已取代了传统方法，可用于分析肿瘤内的特定细胞亚群，但其仍存在局限。因此，将空间分辨率整合到单细胞数据集中成为揭示TME复杂结构的一种有力方法，有助于分析肿瘤细胞与免疫系统之间的相互作用。特别地，空间转录组学、空间蛋白质组学和空间代谢组学及其整合技术的迅速进展，极大地促进了科研人员对组织稳态和癌症相关炎症的理解，并为TME中的细胞间相互作用、多细胞单元等提供了新见解（图1）。

图1. 利用多组学技术解码肿瘤免疫动力学。

加拿大麦吉尔大学Rosalind and Morris Goodman癌症研究所的Daniela F. Quail博士和Logan A. Walsh博士在Nature Immunology上发表了题为"Decoding the tumor microenvironment with spatial technologies"的综述文章，评估了新兴多维空间技术（空间转录组、空间蛋白质组）的优势和局限性，重点关注其在肿瘤免疫学中的应用；阐述了人工智能（AI）出现为空间组学带来的变革，以及整合多组学数据集以全面了解TME的价值。

文章发表于Nature Immunology

01 从细胞悬浮液到空间转录组学

荧光原位杂交（FISH）是一种非放射性原位杂交技术，在20世纪70年代末期由原有的同位素原位杂交技术发展而来，目前已广泛应用肿瘤遗传学等多个领域。基于FISH，1998年科研人员开发了单分子荧光原位杂交技术（smFISH），能够检测RNA分子在细胞中的定位和表达，并标志着彻底进入原位杂交定量时代。2014年，顺序荧光原位杂交（seqFISH）通过整合多轮连续杂交成像扩大了smFISH的多路复用能力。2015年，哈佛大学庄小威团队开发多重容错性荧光原位杂交技术（MERFISH），用于分析单个细胞内数千种RNA物种的拷贝数和空间位置。2019年，加州理工大学Long Cai教授深化seqFISH并推出其升级版seqFISH+，该技术实现了单细胞中>10,000个基因的亚细胞检测，具有低误差率和高的亚衍射极限。至此，空间转录组学技术不断发展、创新。作为FISH技术的补充，2013年原位测序技术（ISS）出现，其可对固定组织或细胞样本中的mRNA进行直接测序，并将NGS优势与显微镜提供的空间信息相结合。

截至2019年底，癌症研究领域出现了两个突出的商业平台，即Visium spatial Gene Expression（10x Genomics）和GeoMx Digital spatial Profiler（NanoString），此类多组学平台可整合转录组数据和蛋白质检测，在更广泛的TME网络和生理状态背景下，全面揭示肿瘤-免疫相互作用。

02 空间蛋白质组学的兴起

空间蛋白质组学是一门新兴的研究领域，其融合了生物学、化学、物理学和计算机科学等多个学科的知识，旨在探究蛋白质在细胞和生物体内的三维结构，根据定量方法的差异可分为三大类：基于荧光成像的空间蛋白组技术、基于质谱的空间蛋白组技术、基于测序的空间蛋白组技术。这项技术的核心是通过使用高级的仪器和计算方法，将大规模的蛋白质样本进行分析，并将获得的数据进行整合和建模，以确定蛋白质的三维结构。

目前两个主要的蛋白质组学质谱成像技术是多重离子束成像技术（MIBI；IONpath）和Hyperion组织成像质谱流式技术（IMC；Standard BioTools），其具有相似的多路能力，但在几个重要方面有所不同：IMC对组织具有破坏性，而MIBI则无。与IMC相比，多种结合循环光谱信号生成的、基于抗体的空间蛋白质组学技术（如CODEX、PhenoCycle；Akoya），为TME分析提供另一种可靠的解决方案，在允许条件下可实现空间单细胞蛋白组学数据整合分析。

为提升传统免疫染色程序，科研人员还开发了针对多重组织学的循环染色方案，如IBEX63、SABER64、RareCyte65等，可用于免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF），其中一些已实现商业化（如Lunaphore的“彗星”平台）。光谱成像系统，如PhenoImager平台（Akoya）或Vectra Polaris（PerkinElmer），利用光谱解混算法分离荧光团的重叠发射光谱，从而增强多路复用能力，已成为肿瘤免疫研究常用的工具。此外，在流式细胞术领域，光谱荧光技术（如Aurora、Cytek Biosciences）也正在超越CyTOF质谱仪（如Helios系统、Standard BioTools）等其他多重免疫组化方法而越来越受欢迎，其更具成本效益、一致性和时间效率。

03 肿瘤代谢的空间分析

识别代谢物的差异和组织的空间组成对于破译肿瘤内异质性和深入了解癌症系统至关重要，但肿瘤的空间代谢特征在很大程度上尚不清楚。随着空间单细胞技术的出现，人们对开发代谢组学的等效能力产生了兴趣，蛋白质组学多重成像工具可以使用代谢酶作为代谢物变化的替代品。

细胞分辨率代谢物谱分析的进展主要集中在脂质组学上。不同质谱成像（MSI）技术，如基质辅助激光解吸电离（MALDI）或解吸电喷雾电离（DESI），能够根据质荷比和特征裂解模式对脂质进行无标记靶向，具有简便的工作流程和多功能性，已成功应用于许多不同的研究领域；但这些MSI方法存在的一个局限性是缺乏细胞鉴定，这提示了将经典谱系标记与代谢组织图叠加的整合蛋白质分析策略的必要性。为实现这一目标，美国佐治亚理工学院Ahmet Coskun团队及其合作者开发了一种单细胞空间分辨代谢（scSpaMet）框架，通过结合非靶向空间代谢组学和靶向多重蛋白质成像来分析TME中的细胞。

综上，代谢MSI与细胞类型识别方法的结合为研究肿瘤-免疫营养分配甚至宿主-微生物代谢依赖性开辟了新的机会，并可用于探索癌症相关微生物群落如何形成抗肿瘤免疫。

04 可视化肿瘤异质性

随着空间分析技术的进步，为适应多组学平台的整合，将这些技术推进到三维（3D）空间是一个自然的发展趋势。

2018年，麻省理工大学研究团队开发了空间分辨转录扩增子读出映射（STARmap），可在单细胞分辨率下同时绘制多个基因图谱，并根据基因集鉴定细胞谱系，保留扩增子的 3D 排列。2021年末，一种基于聚合物和水凝胶的方法的扩增测序（ExSeq）被开发，能够在组织中产生纳米级的RNA图谱。在蛋白质组学领域，三维成像质谱仪（IMC）也逐渐被人们重视、使用，其能够可视化单个细胞的坐标。2023年，科研人员对全滑动序列切片进行高度多路复用的循环免疫荧光，生成细胞状态转变和免疫相互作用的3D图谱。

以CODA技术为例，使用机器学习和H&E染色绘制组织是一种在大组织中可视化组织结构的方法。下一个挑战将是使用深度学习和H&E来辨别特定的免疫亚群。但CODA和3D IMC均依赖于广泛的连续切片，需要对组织进行操作并对3D图像进行回顾性数字重建。

作为一种替代方法，将组织清除技术与高分辨率成像相结合，能够在保持器官系统完全完整的同时重建大组织3D机构，该方法从组织中去除脂质，使其光学透明，随后使用荧光探针标记靶分子。此外，一些组织清除技术（如DISCO）也可与激光捕获显微切割、基于质谱的分析相结合（DISCO-MS）。总之，这些清除技术共同代表了3D空间成像的进一步发展，可了解组织之间和组织内免疫功能的系统动态。

05 分析挑战和多组学数据集成

目前，空间组学的发展面临以下几个挑战：细胞分割、细胞谱系鉴定、空间分析和时空动力学（图2）。

图2. 与单细胞空间组学相关的阶段和挑战

一是细胞分割，复杂的组织结构和细胞形态变化使精确界定细胞边界变得困难，但其准确性完全决定了数据输出的质量。目前已经开发了几种用于细胞分割的创新方法，如CIRCLE、Cellpose和Mesmer。CIRCLE是一个全面的核分割工作流程，整合了基于卷积神经网络的方法和前景检测方法，能够主动细化轮廓，以分离重叠的细胞；Cellpose是一种通用的、基于深度学习的细胞分割方法，可分割不同细胞类型，且不需要调整参数和训练模型；Mesmer是一种能够跨各种组织类型和成像方法进行核和全细胞分割的自动化算法。但随着人们对空间生物学领域的深入探索，当前亟需能够准确对不同组织类型细胞进行分割的创新方法，以解决复杂的细胞形态所带来的挑战。

二是细胞谱系鉴定，基于单细胞转录组学的谱系分配考虑了每个细胞的复杂基因表达模式。空间聚类根据细胞的内在属性和相邻细胞的特征对细胞进行分类，主要方法包括HMRF、GNN。基于深度学习的细胞识别方法也正在推进中，如基于细胞形态的实时细胞分选（COSMOS）或单细胞RNA测序细胞分型（scGPT），以及EcoTyper、ImmunNet。EcoTyper使用批量、单细胞和空间基因表达数据对细胞状态和多细胞群进行广泛检测、验证的；ImmunNet则专门针对多维成像数据中的免疫细胞进行优化。这些分析方法为人们研究抗肿瘤免疫反应的空间结构和伪时间提供了信息。

三是空间分析。除单个细胞外，更大细胞邻域或群落的空间模式和相互作用在决定细胞行为、合作和整体组织动态方面起着关键作用。许多标志性研究都开发了相应的工具来分析空间表型、相互作用、邻域和更广泛的群落，包括但不限于histoCAT、Squidpy、CellCharter、Giotto、BayesSpace和Bioconductor项目中的各种软件包。这些工具通常应用于转录组数据或蛋白质组数据，很少同时应用于两者。目前，开发将空间蛋白质组与转录组整合的分析解决方案是该领域的重点。

四是三维组织分析，新兴工具如CODA或3D多重成像可将分析能力扩展到第三维，其分析的基本原理与2D环境中的基本原理相似。

五是时空分析。活体显微镜实现了免疫细胞行为的3D时空分析，但这种方法受到一次可追踪细胞类型数量的限制。近年来，如ZipSeq、Live-seq等实时单细胞空间转录组学研究的技术已被开发，其他合成记录系统（如MEMOIR、intMEMOIR和Zombie）也已出现，可用于绘制单细胞谱系历史的时空图。开发结合空间、时间和多组学数据的计算框架，并采用机器学习算法进行时间序列分析，为揭示动态细胞相互作用提供了机会。

06 通过人工智能应对临床挑战

空间蛋白质组学技术（如IMC）有望改善临床管理：通过将蛋白质组学特征与临床结果相关联，机器学习模型可识别与疾病进展相关的空间模式和分子特征，能够前瞻性地应用于临床情景中，并帮助指导治疗决策。将深度学习技术应用于早期癌症患者IMC数据集中可以预测患者的复发风险高，准确率超95%，科研人员基于此能够开发更具针对性的治疗策略。此外，将深度学习与其他空间组学数据集（如射线照片）相结合，通过识别人们遗漏的细微模式，能够提高癌症检测准确性。这种方法、技术的整合有望改善早期诊断、更好地预测患者预后和简化放射工作流程，从而提高癌症治疗的效率和效果。

综上所述，空间组学技术的临床应用具有巨大的前景，能够揭示TME复杂性，并有可能重塑精准医学的格局，技术的进步可降低成本并提高可及性。简化、优化这些技术并结合人工智能的力量将其应用于临床，有望改变临床决策、改善患者预后，并为未来个性化疾病管理方法铺平道路。此外，将这些技术提供给相关科研人员或通过开放获取平台共享由其产生的广泛数据集，对于推进治疗和促进新发现至关重要。

论文原文：

Walsh LA, Quail DF. Decoding the tumor microenvironment with spatial technologies. Nat Immunol. 2023;24(12):1982-1993. doi:10.1038/s41590-023-01678-9