Genome Biol：ONT、PacBio长读长测序CpG甲基化检测工具的系统比较

人类DNA的主要修饰是胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG）中的胞嘧啶甲基化，通常称为CpG甲基化或5-mCpG。准确检测5-mCpG模式对于理解基因表达、细胞分化和印记复杂调控机制非常重要。随着长读长测序技术的进步，甲基化检测可以直接从原始序列数据中完成，从而提供了对各种修饰进行检测的可能性，而不需要对DNA进行化学处理。长读长测序最常用的方法是Oxford Nanopore Technologies（ONT）的纳米孔测序和PacBio的单分子实时（SMRT）测序。

冰岛deCODE Genetics公司的研究团队在Genome Biology发表了题为“A comparison of methods for detecting DNA methylation from long- read sequencing of human genomes”的文章，首次对长读长测序的CpG甲基化检测工具进行了系统比较，包括最新的ONT R10.4流动槽化学测序、氧化亚硫酸盐测序（oxBS）以及SMRT测序。通过分析大量基因组，研究发现纳米孔测序在7179个DNA样本中检测的CpG甲基化高度准确，与从同一抽血中分离的132个oxBS测序样本检测一致。此外，该研究引入了CpG的质量过滤器，进一步提高了纳米孔测序CpG甲基化检测的准确性，并同时过滤约30%的CpG。

文章发表在Genome Biology

主要研究内容

研究团队利用ONT的promethION流通池对7179名个体的全血样本进行了测序，同一组样本被用来研究CpG甲基化、基因表达和序列变异之间的相关性。首先，研究团队使用Nanopolish进行CpG甲基化检测，将位于彼此相距10bp以内的CpG分组，称为CpG单元。为每个CpG单元判断其对数似然比（LLR）并分类为是否“可靠”。

1 纳米孔测序和oxBS测序之间的CpG甲基化检测具有可比性

研究团队将oxBS测序的132个DNA样本作为5-mCpG率的基线，平均覆盖率为25×。通过评估oxBS数据的平均5-mCpG率和Nanopolish预测的相应平均5-mCpG率之间的Pearson相关系数来评估Nanopolish的性能，将这种相关性称为CpG平均Pearson相关系数（APC）。分析显示，两个数据集中的5-mCpG率之间的存在高度APC。

此外，通过计算每个个体的总体甲基化水平，研究团队发现纳米孔测序样本的总体甲基化水平平均低于oxBS测序样本（图1A），这些细微差异可能是由于难以将短读长序列与参考基因组精确比对，从而影响两种方法对某些CpGs的检测。

2 纳米孔测序中CpG甲基化检测的一致性

接下来，研究团队对132个个体的DNA样本进行了纳米孔和oxBS测序，并评估了皮尔逊相关性和平均绝对差（MAD），发现高覆盖率样本的相关性明显更高，MAD更低（图1B，C）。随后研究人员计算了每个样本的皮尔逊相关性，对于所有具有高序列覆盖率的CpG位点，支持CpG单元的最低纳米孔测序深度为20×，以获得其5-mCpG率的高可靠检测（图1D）。

为了捕捉甲基化预测的分布，研究团队根据oxBS测序中的甲基化率将配对数据分为四类：未甲基化、低甲基化、间甲基化和甲基化。结果表明，Nanopolish预测与oxBS检测结果一致（图1E）。将分析限制在oxBS测序中至少有25×覆盖率的CpG，在正确预测的CpG单元中，未甲基化CpG的比例最高（86%），其次是甲基化（77%），间甲基化（56%），低甲基化（52%）（图1F）。

图1.纳米孔测序和oxBS测序在相同DNA样本中的性能

3 Nanopolish甲基化预测质量受CpG单元序列背景的影响

研究团队发现，与其它CpG单元相比，位于序列变异5bp内的CpG单元APC较低（图2A）。同时，oxBS测序数据中的链偏倚幅度较低，Nanopolish数据中的链偏倚较高。由于接近序列变异，从一组高质量CpG中排除了最高数量的CpG单元，其次是高链偏倚和低FRR（图2B）。值得注意的是，低甲基化（50%）和间甲基化（51%）CpG单元从一组高质量CpGs中过滤的比例高于非甲基化（17%）和甲基化（19%）（图2D）。由于高链偏倚，大多数CpGs（57.7%）从低甲基化组和间甲基化组中过滤。

图2.通过DNA序列属性检测5-mCpG率的质量

此外，研究团队使用Guppy（版本6.2.1）预测了304个样本中CpGs的5-mCpG率。Guppy和Nanopolish的甲基化调用高度相关。Guppy的oxBS数据APC高于Nanopolish。Guppy的总体5-mCpG率相比oxBS较低。对于大多数样本，Guppy和oxBS之间的相关性高于Nanopolish和oxBS。Guppy的平均每样本链偏度和MAD也较低。

4 纳米孔测序、SMRT测序和oxBS测序的CpG甲基化检测比较

研究团队在R9.4和R10.4流动槽上对样本进行了测序。在R10.4流动槽中，所有CpGs的oxBS数据和纳米孔数据预测的5-mCpG率之间的APC更高，准确性更高。随后，研究团队对50个人的全血样本进行了SMRT测序。SMRT测序和纳米孔R9.4和R10.4测序方法的平均N50相似，但SMRT测序的平均测序错误率低于两种纳米孔测序方法中的任何一种。SMRT测序和oxBS数据中所有27,527,663个常染色体CpGs的预测5-mCpG率的APC为0.97010，MAD为0.05691。应用同样的质量过滤器后，确定了22,554,423（81.9%）个高质量CpG，APC为0.979956。

最终，研究团队比较了所有五种方法（SMRT、R9.4-Guppy、R10.4-Guppy、R9.4-Nanopolish和oxBS）之间的APC相关系数以及5-mCpG率和oxBS之间的绝对差异。应用于R10.4的Guppy和应用于R9.4的Guppy的APC最高。与oxBS相比，应用于R10.4的Guppy的APC最高，MAD最低。但方法之间观察到的APC和MAD的一些差异可能是由于样本的年龄、性别或吸烟状况的差异造成的。

5-mCpG率的分布

在50个个体的五个子集中计算所有个体的5-mCpG率，得到了所有方法的预期双峰分布（图3A，B）。相比于R9.4流动槽，Guppy应用于R10.4流动槽更接近oxBS测序样本中的甲基化分布模式。此外，所有方法显示的间甲基化CpG数量都高于oxBS测序。Guppy R10.4和SMRT的高质量CpG的分布相似，低甲基化和间甲基化CpGs的比例略低。与Nanopolish相比，Guppy R10.4和R9.4由于链偏倚和异常覆盖，过滤的CpGs较少。

功能区的5-mCpG率

研究团队计算了相对于全血中表达基因的转录起始位点（TSS）开始的50bp间隔内的平均5-mCpG率。所有甲基化检测方法都严格复制了oxBS测序样本中观察到的甲基化模式，表明TSS内缺乏甲基化（图3C）。值得注意的是，SMRT和Guppy R9.4在TSS上表现出较高的CpG甲基化率，在远离TSS的地方表现出较低的甲基化率（图3A，B）。应用于R10.4流动槽的Guppy更接近oxBS中观察到的TSS甲基化水平（图3C）。此外，Nanopolish在未甲基化的CpG单元中具有最低的MAD。

长读长测序检测到更多CpG

研究团队比较了每种基于长读长测序方法对每个样本的CpGs检测数量，发现它们都检测到相似数量的CpGs。在常染色体上，用于长读长测序的所有三种甲基化检测工具都检测了相似数量的CpGs，oxBS检测的CpGs最少（图3D）。

图3. CpG甲基化检测方法的比较

结 语

该研究表明基于纳米孔测序的CpG甲基化检测是高度准确的，即使对于具有高错误率的样本也是如此，SMRT测序显示了类似的结果。研究显示：

1.更高的覆盖率是CpG甲基化准确检测的重要因素；

2.纳米孔测序数据中的链偏倚在oxBS数据中未观察到。链偏倚随着较低的错误率和更准确的作图和甲基化预测而降低。

3.所有方法的甲基化预测都高度相关，并且与oxBS的5-mCpG检测一致。

4.根据研究确定的质量参数排除了CpG（过滤了7%至30%的CpG），从而提高了5-mCpG的一致性。

5.长读长测序比oxBS检测到的CpG多约3%。

论文原文：

Sigurpalsdottir, B.D., Stefansson, O.A., Holley, G. et al. A comparison of methods for detecting DNA methylation from long-read sequencing of human genomes. Genome Biol 25, 69 (2024). https://doi.org/10.1186/s13059-024-03207-9