熊建萍教授组稿：代小峰医生：结直肠癌PD-L1调控新机制-靶向TMEM（X）增强ICB治疗疗效

1 结直肠癌免疫治疗现状

结直肠癌（CRC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，年新发病例超15万，位居全球癌症发病率第三位；年死亡人数超过5万，是第二大癌症相关死亡原因^[1]。随着精准医学的发展，基于患者分子分型的靶向联合化学治疗是转移性结直肠癌（mCRC）患者的主要治疗方法。近年来，免疫检查点阻滞剂（ICB）已经改变了许多实体瘤治疗的规则 ，ICB主要通过解除肿瘤对T细胞的制动作用而恢复免疫系统的激活，其效果在多种晚期肿瘤（如非小细胞肺癌、肝癌等）中得到验证并被批准用于临床^[2，3]。在mCRC中，ICB也被应用于一些特殊类型的患者，如错配修复功能缺陷 (dMMR) 或微卫星高度不稳定性 (MSI-H) 的患者^[4]。遗憾的是，ICB治疗扩展到错配修复功能正常（pMMR）或微卫星稳定（MSS）的结直肠癌患者时，总体反应却不尽人意。

PD-L1通过直接结合免疫抑制受体PD1抑制T细胞激活和功能，除了参与诱导和维持正常的免疫耐受外，还经常在肿瘤细胞上被发现，并作为抗癌免疫的检查点。许多基于抗体的药物已经被开发出来来阻断PD-L1/PD1的相互作用，目的是恢复细胞毒性T细胞对肿瘤的效应反应。值得注意的是，PD-L1的表达水平在实体瘤ICB治疗中的预测作用已被多项研究所肯定^[5]。然而，CRC患者中PD-L1表达与ICB治疗的相关性尚不明确，多项实验得出的结果并不一致^[6]。并且，当前对CRC中PD-L1表达的调控机制的认知相对不足。因此，有必要揭示CRC中调节 PD-L1 的分子机制，这将进一步提供潜在的策略来提高抗 PD-1/PD-L1治疗的临床疗效。

2 PD-L1的转录后修饰

PD-L1的翻译后修饰（PTM）被认为是一种抵抗免疫检查点封锁的机制。PD-L1受到多种翻译后修饰的调控，如泛素化、磷酸化、糖基化和棕榈酰化^[7]。最近的报道描述了在翻译后水平上控制PD-L1丰度的不同机制，如蛋白酶体介导或溶酶体介导的降解，而泛素蛋白酶体系统对PD-L1的调控尚未完全了解^[8，9]。

3 跨膜蛋白（TMEM）家族

跨膜蛋白(TMEM)家族成员是一类跨越脂质双分子层的跨膜蛋白，在正常生理功能和多种疾病发生过程中中发挥着重要功能，如肝脏的发育和分化、炎症的发生等^[10，11]。另有多项证据显示TMEM家族成员与多种肿瘤的发生、侵袭和转移有着密不可分的关系^[12，13]。在肿瘤免疫中，干扰素基因刺激物(STING)，也称为 TMEM173，扮演着重要角色^[14]。在转移性肿瘤细胞中，STING信号的慢性激活导致了 I型 IFN的抑制、indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO)的释放和非经典 NF-κB 信号的上调等情况的发生，这有助于肿瘤细胞免疫逃逸和转移^[15]。同时，STING 还可促进 PD-L1 的表达和诱导自噬^[15]。研究指出结肠癌中STING 的活性经常受到抑制，这有助于结肠癌细胞躲避免疫系统的监视^[15]。然而，另一项研究指出，MMR 蛋白的功能缺陷会引发细胞质中 DNA 的异常积累，这促进了肿瘤细胞内cGAS-STING 先天免疫通路的内在激活^[16]。这些事件形成了具有免疫活性的 TME，并可能是dMMR型CRC患者使用 ICB治疗有效的原因之一^[16]。组成性激活STING信号通路，即使在 MMR 蛋白功能正常的肿瘤中，也可以增强肿瘤细胞对ICB 治疗的敏感性^[16]。

4 课题组研究进展

我们课题组重点研究了PD-L1去泛素化的调控机制，这被认为是维持其蛋白稳定性及其抑制免疫功能的一种保护机制。为研究PD-L1调控CRC进展的机制，我们通过蛋白互作网站发现，PD-L1可与TMEM家族中一成员（后文简称TMEMX）相互作用，接着我们展开免疫荧光（IF）、蛋白质免疫共沉淀（Co-IP）、GST-pull down和泛素化等实验证明PD-L1的确可与TMEM直接结合，且TMEM（X）可减少PD-L1的泛素化降解；接下来为验证TMEM（X）能否调控PD-L1的表达，我们分别使用siRNA和过表达质粒转染不同的结直肠癌细胞，通过蛋白免疫印迹（WB）及实时荧光定量（Q-PCR）发现，TMEM（X）表达减少后PD-L1蛋白表达也相应减少，而过表达TMEM（X）后PD-L1表达也随之增加且存在剂量依赖性，但是TMEM（X）不影响PD-L1 mRNA的表达，这说明TMEM（X）在转录后水平调控PD-L1的表达。我们还进行了淋巴细胞与肿瘤细胞共培养实验，结果发现下调TMEM（X）会增加结直肠癌细胞的凋亡率，使结直肠癌细胞对淋巴细胞介导的细胞杀伤功能更加敏感。

随后我们进行动物实验，使用Sh-NC、Sh-TMEM（X）慢病毒稳转结直肠癌细胞株HCT116及CT26，分别接种在BALB/C-nude及BALB-C小鼠皮下，结果发现在严重免疫缺陷的NCG小鼠中，shTMEM（X）细胞来源的肿瘤生长与shNC对照细胞稍缩小，相反，我们发现shTMEM （X）在很大程度上限制了免疫活性BALB/C小鼠中肿瘤的生长，这表明TMEM（X）在肿瘤免疫逃避中起着关键作用。最后我们收集了128例临床样本进行免疫组化（IHC）及生存分析发现，TMEM（X）在CRC组织中的表达量高于正常组织，同时TMEM（X）的表达与PD-L1的表达呈正相关，与CD8阳性T细胞呈负相关，高表达TMEM（X）的结直肠癌组织同时高表达PD-L1，而CD8阳性T表达减少；Kaplan-Meier生存分析发现TMEM（X）高表达的患者的总生存期明显短于TMEM（X）低表达或不表达的患者，提示TMEM（X）具有重要的临床意义，可作为预测结直肠癌预后的生物标志物。

总之，我们的研究揭示了在结直肠癌中TMEM（X）与PD-L1结合，从而减少PD-L1的泛素化降解以促进结直肠癌细胞免疫逃逸。免疫治疗是近些年新兴的抗肿瘤疗法，如何提高免疫治疗的疗效也是研究者们讨论最多的话题之一，基于我们的研究，我们认为结直肠癌细胞TMEM（X）表达水平可能作为预测免疫治疗疗效的生物标志物。

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