从魔剪到六脉神剑，CRISPR多重编辑时代到来？

2015年，《科学》杂志把CRISPR-Cas9基因编辑技术评为最重要的“突破性发现”，众多科学家普遍认为CRISPR/Cas9是上个世纪70年代生物技术（biotechnology）时代以来出现的最为重要的基因工程技术之一。

▲CRISPR-Cas9系统是微生物对付外来DNA的防御系统之一（图片来源：Wikipedia）

其实，CRISPR-Cas9系统只是进化过程中细菌微生物演化出的一种对付外来DNA（诸如病毒）的防御系统之一。

微生物的适应性免疫系统CRISPR通过两类不同的RNA引导的核酸酶效应系统来介导对针对外源遗传元件的防御。第1类（Class 1 ）效应分子系统利用多蛋白复合物，而第2类（Class 2）效应分子系统依赖于单组分效应蛋白，例如上述的的Cas9蛋白。 2015年9月，以张锋教授研究团队为主的科学人员报告新的一个2类CRISPR效应分子Cpf1：以“Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System”为标题发表在2015年九月的《细胞》杂志上。他们证明Cpf1具备介导强大的DNA干扰并且不同于Cas9的功能。Cpf1是不需要tracrRNA的单一RNA指导的内切核酸酶，并且利用富含T碱基的间隔物相邻基序（PAM）。此外，Cpf1通过交错方式切割DNA双链。在16个Cpf1家庭蛋白质中，他们首先从酶酸性氨球菌和螺旋藻科确定了两个候选物，可以在人类细胞中展示有效的基因编辑活性。

▲CRISPR-Cpf1系统可有效介导基因编辑（图片来源：《细胞》）

发现这个新的基因编辑效应分子后，科学家们认为可以弥补CRISPR-Cas9技术平台的部分限制和“先天不足”：

• Cas9核酸酶通过识别染色体上的PAM序列来锁定目标。Cas9所需的PAM往往是鸟嘌呤富集（Guanine-rich) 的部位，于是大大限制了目标切点的可选择性。

• Cas9核酸酶切割双链DNA是会产生平端(Blunt end) ，再通过细胞自身的同源重组修复系统（HR）或非同源粘合系统（NHEJ)的方式修复DNA，同时也可人为得到基因编辑的目的。但是平末端修复进行基因编辑较为随机和低效。

那么Cpf1的蛋白有哪些特征可以克服CRISPR-Cas9系统应用中的一些不足呢？

• Cpf1酶比目前广泛使用的标准Cas9酶要小，更容易进入细胞内部。

• Cas9剪切DNA需要crRNA和tracrRNA两个RNA小分子，而Cpf1只需要crRNA，不需要tracrRNA。于是，Cpf1系统更加简单。

• Cas9是在同一个位置同时剪切DNA分子的双链，最后形成的是平末端；而Cpf1酶剪切后形成是两个不同长度的DNA链，即我们通常熟知的粘性末端（sticky-end）。平末端通常不容易进行下游处理，而粘性末端让DNA插入更好控制。

• Cpf1复合物可识别的PAM序列比Cas9的选择范围更多。

基于上述种种Cpf1介导的基因编辑的优势和特征，以张锋教授研究团队为主的科学人员假设Cpf1可能足以用于pre-crRNA成熟——这对基因组编辑有重要的意义，因为它将提供一个多重靶向基因编辑的的简便途径。过去一直用Cas9靶标多个基因组位点的时候，研究人员需要构建多个或者碱基数很大的表达载体，使得多重基因编辑受到很大局限。

本周在《Nature Biotechnology》杂志上发表的“Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 through autonomous processing of a single crRNA array”论文里面，他们的结果显示：Cpf1可以成功加工自身所需的crRNA；不再需要其他分子的支持；Cpf1介导的pre-crRNA加工而且独立于DNA剪切的。利用这些原理，研究人员成功设计了一个单CRISPR阵列表达载体，该载体同时在哺乳动物细胞编辑修改了四个基因，在小鼠大脑组织编辑了三个基因——也就是说在细胞品系和动物体内简单有效完成了多重基因编辑的目的。

▲Cpf1系统更加简便（图片来源：《Nature Biotechnology》）

有效进行多重基因编辑不仅仅在遗传学、发育学和细胞学等基础领域有极其重大的意义，在临床医学研究上也逐渐被应用和重视。

比如说，在CAR-T肿瘤免疫疗法的设计层面上，研究人员希望可以使用异体的CAR-T细胞来治疗多个患者。但前提是必须必须保证其安全性，确保供体细胞不会攻击患者受体，同时降低避免宿主细胞的攻击。为了达成这些目的，科研人员已经开始使用CRISPR编辑技术将TCR基因从异体的CAR-T细胞中敲除，避免移植物抗宿主病（GVHD）的发生；同时也尝试将人类白细胞抗原（HLA）基因敲除，来降低自身免疫原性。另外，科学人员也认为有必要在CAR-T细胞中敲除了PD-1（肿瘤免疫逃逸相关的T细胞表面抑制因子）基因来阻断PD-1信号通路。

举例来说，两篇近期发表的论文就是使用了CRISPR-Cas9介导的DNA核酸酶系统进行了尝试性的多重基因同时编辑，来推动异体CAR-T细胞制备的需要。一篇是发表在《Clinical Cancer Research》上面的论文，题为“ Multiplex genome editing to generate universal CAR T cells resistant to PD1 inhibition”，通讯作者之一为CAR-T领域的领军人物Carl June教授。另外一篇是发表在《自然》旗下《Cell Research》杂志上，题为 “CRISPR-Cas9 mediated multiplex gene editing in CAR-T cells”的，该文由中国科学院动物研究所王皓毅研究组等众多中国科学家协力完成。

▲医学研究人员已经开始尝试使用CRISPR基因编辑技术来制备安全通用型的CAR-T细胞（图片来源：《Cancer Research》和《Clinical Cancer Research》 

这些初步研究结果表明，经过多重基因编辑的CAR-T细胞与普通CAR-T细胞相比，可呈现更强的肿瘤细胞杀伤功能，可望成为安全型的效应细胞，在临床得以应用。基于上面所综述的一系列研究结果和原理，我们期望涉及Cpf1多重基因编辑的研究应用会在CAR-T细胞治疗领域大显身手，为异体通用型CAR-T的制备提供更加完善、高效且简便的基因编辑技术平台。

原始出处：

Zetsche B1, Gootenberg JS2, Abudayyeh OO3, Slaymaker IM3, Makarova KS4, Essletzbichler P3, Volz SE3, Joung J3, van der Oost J5, Regev A6, Koonin EV4, Zhang F7.Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.Cell. 2015 Oct 22

Bernd Zetsche, Matthias Heidenreich, Prarthana Mohanraju, Iana Fedorova, Jeroen Kneppers, Ellen M DeGennaro, Nerges Winblad, Sourav R Choudhury, Omar O Abudayyeh, Jonathan S Gootenberg, Wen Y Wu, David A Scott, Konstantin Severinov, John van der Oost, Feng Zhang.Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 through autonomous processing of a single crRNA array.Biorxiv.October 1, 2016.