关于病毒抗原检测，检验人需要了解的前世今生：

——在准备应用新冠核心抗原试剂之前，我们应该有哪些知识储备？

杨瑞锋

北京大学人民医院，北京大学肝病研究所；

丙型肝炎和肝病免疫治疗北京市重点实验室；国家感染性疾病临床医学研究中心分中心

最新出台的新冠诊治指南将病毒抗原检测提上了议事日程，国内的厂商和实验室摩拳擦掌，跃跃欲试。相比疫情伊始的抗体和火爆至今的核酸检测，抗原检测对很多人来说稍显陌生。对其临床应用场景和结果解读的讨论，让人仿佛又回到了2020年初，那时针对“务工人员到底要不要大面积检测新冠抗体”这个问题，就曾经有过热烈的讨论，看来人类总是自觉不自觉踏入相同的河流。笔者借助本文对病毒抗原检测做些介绍，希望大家在使用和解读这个标志物时能更加得心应手。

01

当检测病毒抗原的时候

我们在检测什么？

病毒分为包膜病毒和非包膜病毒两大类（见下图），前者穿外衣，多通过血液或呼吸道传播；后者没穿外衣“裸奔”，不过其“内衣”相当坚固，可忍受恶劣的环境如消化道，可通过粪-口传播。

临床上，病毒的抗原检测，多半检测的是核心抗原，少部分检测表面抗原，见下图。

表面抗原是包膜病毒外衣的成分，携带打开宿主细胞的钥匙，如HBV的HBsAg、HIV的gp120/gp41，SARS-CoV-2的刺突（S）蛋白等；而核心抗原作为病毒的“内衣”，除了能保护其关键部位外，也为其繁衍后代提供安逸的场所和催生情愫的环境。不过，不同内衣的款式不同，有的是类球形多面体（HBV，HCV），有的接近椭球型（HIV），有的螺旋、卷曲状包绕RNA（新冠病毒），有的则是以多聚体的形式依附于病毒基因组之上（流感病毒），见下图。

02

病毒核心抗原检测

技术难点在哪里？

• 有些病毒需要将核心抗原暴露才能很好检测

由于核心抗原深藏病毒内部，如果病毒外膜致密，需要破膜后将核心抗原暴露，方能检测。

• 可能需要阻止核心抗体与核心抗原的结合

核心抗原往往激发强烈的免疫反应，产生核心抗体，核心抗原-抗体-免疫复合物（CIC）若形成，会损害抗原检测灵敏度

• 有些病毒太过吝啬，合成核心抗原量极少

检测底物浓度越低，对检测试剂灵敏度和特异性的要求就更高。

上述三点难点集于一身的典型的例子就是HCV核心抗原。检测时，需对样本预处理，去除外膜，暴露核心抗原，且将CIC解离（见下图）。同时，血清里能检测到的抗原浓度往往很低，考验试剂研发的技术功底。当前只有国内外少数试剂商提供试剂盒，如美国雅培、中国莱博和科美公司等。

同理，HBV核心抗原检测，一直是乙肝“两对半”中缺失的那半对，可见其检测难度之大。当前能检测乙肝核心抗原的试剂商，只有日本富士瑞必欧公司。

03

核心抗原既然检测有难度

那为何不检测表面抗原？

表面抗原虽位于病毒表面更好检测，但其对宿主的免疫攻击首当其冲，比核心抗原更易变异。不论是HCV的E（envelope）蛋白、HIV的gp（glycoprotein）120/gp41，SARS-CoV-2的S（spike）蛋白，还是流感病毒（Flu）表面的血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA），这些位于表面的抗原都高度变异，不易被稳定测到，并不适合作为试剂检测的靶点。相反，核心抗原在进化中高度稳定，有稳定的表位可作为检测的靶点。

HBsAg是少数几个例外之一，不同HBV毒株HBsAg变异很小，所以HBsAg成了感染筛查的重要标志物。正因其稳定性，人类得以研发出高效的预防性疫苗，从而有效地控制住了HBV的流行。

04

抗原与核酸有什么关系？

简单理解，核心抗原和病毒核酸是“夫唱妇随”的关系，在病毒繁殖过程中缺一不可。以HIV生命周期为例，当两个拷贝的RNA被制造出来的时候，也伴随1500个p24蛋白单体被表达，并自动组合成壳状、致密的蛋白层（核衣壳），将RNA紧密包裹。HIVRNA拷贝数（copies，或称病毒载量）和p24检测信号-界值比（S/Co）值呈严格的正相关性，见下图。

同样，HCV、Flu和SARS-CoV-2等也遵循此规律。HBV的核心蛋白和DNA含量也呈正相关性，但相关性不及其他病毒强，这是因为HBV会合成冗余的核心蛋白。

05

相比抗体，抗原检测的优势是什么？

核心抗原摩尔数与核酸拷贝数遵循正相关关系，因此，检测核心抗原的临床价值和核酸重叠，即，都是病毒复制的直接指标。

• 在感染早期，抗原/核酸的产生早于抗体，所以，诊断窗口期更短。

• 抗原/核酸的产生不像抗体那样易受宿主免疫状态的影响，可用于免疫虚损人群。

• 大面积灭活疫苗的接种，使人群中普遍产生针对各种病毒蛋白的抗体，因此，新冠抗体诊断价值消失殆尽，但抗原/核酸仍然有诊断价值。

• 抗原/核酸定量还可以作为病情进展或治疗应答的标志物。

06

相比核酸

抗原检测有什么优势？

• 简单。

美国FDA将核酸检测列为高度复杂的试验操作，而基于胶体金抗原快检（POCT）试验则为低难度操作，且为豁免试验（waivedtest），对操作者不需要那么高的要求，所以也可居家检测。

• 便宜（虽然目前也没那么便宜）。

• 快（比POCT核酸试剂还是更快些的）。

• 没有气溶胶污染PCR导致核酸结果“假阳性”之虞。

07

抗原检测如此多优点

一定会在市场上受到追捧了吧？

并非如此。如上所述，抗原检测有诸多优点，但在临床，它却往往不太受待见，像个窝囊的丈夫，遭受媳妇儿和妈妈的夹板气。

如前所述，HCV抗原试剂研发难度大，目前仅有国内外少数试剂商提供试剂，但市场推广仍然不太理想，因为在筛查方面，HCV抗原没有抗体简单、便宜，而在确诊和治疗监测方面，抗原又不及HCVRNA应用广泛。

检验科对HIVp24试剂的应用，同样是意兴阑珊。

而对于HAV和HEV而言，有IgM抗体检测，似乎就已经足够，对核心抗原检测的临床需要也没有那么强烈。

08

是因为病毒抗原检测有阿喀琉斯之踵吗？

是的。与核酸相比，灵敏度差2-3个数量级，就是核心抗原检测最大的局限。

以HIV检测为例，理想的模型中，1个HIVRNA对应750个p24单体，所以，病毒核心抗原的数量，要高于核酸拷贝数2-3个数量级，但是，核酸检测基于以聚合酶链反应（PCR）为代表的核酸扩增技术，1个拷贝的核酸，可被扩大至1012拷贝，因此核酸检测可以实现超敏检测，这就让最灵敏的抗原试剂都难以望其项背——毕竟抗原检测是基于抗原-抗体结合的免疫学技术（如化学发光技术、胶体金POCT），无法实现抗原或检测信号的指数级放大。

囿于现有的免疫学检测技术，只有抗原积累到足够多，同时，当核酸复制积累到103~105拷贝的时候，抗原才能被检测到。新冠抗原的灵敏度同样不足，若应用于检测，则存在前后时间点的漏诊，见下图。

此外，抗原检测的特异性也不及核酸。免疫学试验都有一定比例的非特异性反应，导致“假阳性”结果。所以，没有任何一款免疫学试剂宣称自己的特异性是100%。尽管优秀试剂会有添加抗干扰组分从而有效降低非特异性，但不可能完全消除假阳性结果。

09

相比核酸检测

新冠抗原检测到底有多不灵敏？

以一款国外成熟应用的新冠抗原试剂——AbbottBinaxNOW核心抗原POCT试剂为例，有研究报道，100份RNA检测Ct值<30的样本中，51份可实现病毒的分离培养（提示具有潜在的传染性），而BinaxNOW可检测出51份中的45份(88.2%)。

该研究提示，与Ct值动辄为40的高敏核酸试剂相比，抗原试剂在Ct值<30时，仍只有不到一半的检出率，说明新冠抗原灵敏度与核酸相比，差距为10个Ct值以上，即至少差距210倍（1024倍），这跟我们既往使用HCV核心抗原和HIVp24的数据也吻合。新冠抗原这个灵敏度，也不能保证核酸检测Ct<35的患者被抗原试剂筛出，而Ct<35被最新版的指南认为是有传染性的。

10

如何正视抗原检测灵敏度不足这一局限？

灵敏度差，是抗原检测技术与生俱来的缺陷，特别是国内外技术主流都是基于POCT，给试剂厂商辗转腾挪继续提升灵敏度的空间并不大。因此，继续过分强调灵敏度，就有强人所难的意味，因为，枉顾技术平台的局限，一味调高试剂的灵敏度，势必会牺牲特异性，增加假阳性率。

如果一些厂商为了性能数据的好看，刻意淡化试剂灵敏度低的劣势，刻意调高试剂的灵敏度，会导致试剂在真实使用时，特异性受损，假阳性结果偏多。笔者认为这种刻意的“平衡”并无必要。

11

不正视抗原检测灵敏度低的特点

会有什么后果？

所谓灵敏度、特异性，是针对试剂性能而言；应用到临床，医生关注的指标却是阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV）。因为，PPV能回答阳性结果有多大把握是真阳性、可确诊；而NPV可以回答阴性结果又有多大把握排除诊断，见下表。这四个貌似简单的统计学指标，却可能是很多人至今理解上的噩梦。

NPV和PP除了与试剂的灵敏度和特异性有关以外，还受人群传染病流行率的影响。举例说明，若用同一款抗原POCT试剂（灵敏度和特异性都是95%）检测不同流行率的人群，得到的PPV和NPV会迥异，尤其是在流行率无限接近于0时（类似于现阶段国内的新冠流行率），PPV也急速降低，趋向于0，而NPV趋向100%，如下图。这种极端的情形下，核心抗原检测首先容易暴露的问题反而不是灵敏度不足，而是因为特异性不够而产生海量的假阳性结果，可能引起不必要的恐慌。

而特异性无限接近100%的核酸试剂，则没有这种顾虑，因为PPV始终接近100%。这也是为什么核酸检测备受追捧的原因。这也提示我们，我们更应正视抗原检测试剂灵敏度不足的固有局限，哪怕牺牲一定的灵敏度，也应保证特异性不受影响。

12

新冠抗原试剂到底适合不适合广泛筛查？

这个问题容易让人联想到2020年初，针对“务工人员到底要不要大面积检测新冠抗体”这个问题的讨论和争议。笔者认为，不论从统计学角度出发，还是从应用逻辑出发，新冠抗原同样不适合做筛查。

即使抗原检测能满足前述的、特异性为100%的苛刻条件，没有假阳性结果的产生，也不适合做筛查试验。因为，抗原检测固有特点就是灵敏度低，与筛查试验对试剂高灵敏度的要求本身就相悖。

由此可见，高敏、特异的核酸检测仍然无法被取代。

13

新冠抗原检测

该如何发挥应有的价值？

笔者认为，新冠抗原试剂也有其生存空间，最合适应用的场景，可能和流感抗原试剂类似。流感抗原POCT同样有灵敏度不足的局限，但在临床使用多年，基本能满足诊断需求，因为其做到了灵敏度和特异性较好的平衡——灵敏度不及流感核酸，但因此导致的漏诊率不高，且漏诊的后果并非特别严重（往往漏诊的都是低病毒载量、传染性弱，病情趋向好转的患者）；同时，特异性也控制得不错，没有高到离谱的假阳性率导致误诊。新冠抗原可以借助这个模式，即，用于临床门急诊疑似病例的诊断，阳性则有很大把握诊断为新冠，而阴性则需要进一步检测核酸。

总而言之，笔者认为，还是应突出抗原检测特点——灵敏度不及核酸，但特异性好，PPV高，简单、快速，应用场景更灵活。为了灵敏度数据的好看，无节制地上调灵敏度，势必导致特异性被牺牲，这种抗原试剂可能参数好看，但往往弄巧成拙，实际使用价值被大打折扣。不要为了上市而上市——临床需要和患者利益永远是第一位的。

参考文献

1. J Clin Microbiol 56:e02045-17

2. 临床肝胆病杂志, 2011, 027(001):1-7

3. 中国临床新医学, 2021,14(1):1-7.

4. 临床检验杂志，2021,39(11):809-812.

5. https://spartanmedspine.com/covid-19-solutions/viral-antibody-tests/

6. Emerg Infect Dis. 2021,27(11):2761-2767.

7. https://www.fda.gov/media/137612/download