肝硬化逆转化分析与途径研究

在正常肝脏中，HSCs约占肝驻留细胞总数的15%和肝非实质细胞的30%，通常表现为静息状态并含有脂滴。但在肝脏受到损伤时，不同炎症因子导致HSCs激活或转分化为具有高度增殖性和收缩性的肌成纤维细胞，持续的HSCs激活释放的细胞因子可增强炎症和纤维化组织反应。目前靶向HSCs的治疗已经取得了较多成果，主要有两种治疗方法。

1.1 促进HSCs衰老和凋亡

利匹韦林（Rilpivirine，RPV），是一种抗逆转录病毒药物，在肝脏毒性和脂质特性方面更具有安全性。研究者已在细胞和实验动物层面证明 RPV 能够通过JAK-STAT 通路调节STAT1 (signal transducer and activator of transcription 1)和 STAT3 之间的平衡，通过 STAT1 的选择性调控诱导HSCs凋亡，可在不同的慢性肝损伤实验模型中，改善炎症和肝纤维化，凋亡HSCs分泌的IL-6还能特异性激活肝细胞中STAT3，以增强肝再生。aHSCs还具有以NF-kB(nuclear factor kappa B)依赖的方式增强生存率的特征，从而促进纤维化，因此，抑制NF-kB通路可能通过诱导HSCs凋亡来抑制肝纤维化。

除此之外，CCN家族基质细胞蛋白，富含半胱氨酸的蛋白61（CCN1/CYR61）通过减弱TGF-β信号通路来促进HSCs的衰老和凋亡。纤维连接蛋白肽可以通过aHSCs凋亡导致自限性反应，最终限制慢性纤维化的发展。

1.2 抑制或逆转HSCs活化

成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）是在肝损伤中表达增加的主要生长因子家族之一，FGF信号除了加速损伤肝脏的再生外，还会导致纤维化的发展。研究表明CCL4诱导的肝纤维化在FGF1/FGF2缺陷小鼠中显著降低；2020年Wang等的研究再次证明，抑制FGFR（fibroblast growth factor receptors）信号通路通过抑制促炎细胞因子的分泌和MMPs的表达，特别是MMP9的激活，抑制单核细胞对HSCs的黏附，且在炎症阶段抑制FGF信号以抑制HSCs的活化来减轻纤维化的进展。胶质细胞系来源的神经营养因子 (glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)，是TGF-β超家族的一员，可通过 Ret/ALK5 受体以及AKT(AKT serine/threonine kinase 1) 和 Smad(mothers againstdpp)通路诱导HSCs激活，阻断GDNF 可抑制HSCs的激活而抑制纤维化进展。

目前多项研究表明过氧化物酶体增殖物激活受体 (peroxisome proliferator activated receptor gamma，PPARγ)是HSCs激活和表型改变的关键介质，可影响HSCs处于静息期的状态。Lu等研究发现，大鼠在低氧刺激下引起肝纤维化，HSCs 活化标记物增多，同时伴随着 PPARγ表达的降低，而通过体内外加入PPARγ激动剂可以减少HSCs活化和胶原沉积，抑制肝纤维化。

肝纤维化的一个重要特征是肝脏结构的破坏和过度的ECM 合成和沉积。正常肝脏中ECM的含量非常有限，但其构成了一个复杂的结构支持性蛋白质网络，在调节组织稳态、重塑和再生中发挥重要作用。ECM成分的交联，特别是纤维胶原和弹性蛋白，与纤维化进展密切相关。越来越多的证据表明，ECM降解可能参与肝纤维化的自发溶解。

2.1 减少胶原产生

减少胶原产生是肝纤维化逆转的重要策略之一。C9复合物可以抑制LARP6（La ribonucleoprotein 6）与编码I型胶原的mRNA结合，从而抑制动物模型中的纤维化发生，还可以减少HSCs的I型胶原分泌。趋化剂受体同源分子（prostaglandin D2 receptor 2，CRTH2）是前列腺素D2的质膜受体，锚定的CRTH2可以与LARP6的胶原mRNA识别序列结合，并促进细胞中胶原mRNA的降解。Fan等研究发ECM1敲除小鼠可自发发展为肝纤维化，并在第2个月时死亡；而且ECM1可通过与αv整合素相互作用使TGF-β保持在非活化状态以抑制 肝星状细胞活化和肝纤维化的发生。抑制素家族中的β-抑制素2随着肝纤维化的进展而表达增加，小鼠模型和体外实验均表明降低β-抑制素2的表达可减少胶原的表达并改善纤维化。也有研究表明，相比于减少胶原的产生，增强金属蛋白酶的活性，减弱其抑制剂的表达在肝纤维化回归中更为重要。

2.2 增强ECM的降解

在纤维形成过程中，I型、III型胶原以及纤维连接蛋白逐渐取代正常肝脏中IV型、VI型胶原，这种高度稳定和交联的ECM分子可以被MMP特异性降解。TIM可导致基质金属蛋白酶的催化活性下降，多项研究表明TIMP的持续产生似乎是纤维化进展的关键。早在2003年发现腺病毒介导的MMP1表达可以改善TAA诱导的大鼠肝纤维化，并提出ECM的降解伴随着aHSCs的抑制和凋亡。在CCl4和胆管结扎诱导的肝硬化大鼠模型中，腺病毒载体介导的MMP-8过表达可以逆转纤维化，并改善肝功能和肝内血压 ，同时降低TGF-β表达，而MMP-9和HGF（hepatocyte growth factor）表达升高。MMP-9 突变体可作为TIMP-1拮抗剂以减弱CCl4诱导的纤维化；除此之外，Tsay等提出，抑制肝细胞中miR-221-3p会导致沉积的细胞外基质的更快溶解；下调 miR-221-3p 可诱导肝细胞中 GNAI2 的表达，抑制CCl2的分泌，从而导致HSCs活化减少，改善肝纤维化。

2.3 改变ECM的空间构象和基质刚度

赖氨酸氧化酶（lysyloxidase，LOX）和赖氨酸氧化酶样蛋白 2（lysyl oxidase like 2，LOXL2）都在肝纤维化的缺氧环境中表达上调，其赖氨酸残基可诱导纤维蛋白的共价交联，增加对ECM降解的抵抗，促进肝纤维化的稳定和积累。近来Klepfish 等提出，使用一种新型抗LOXL2 中和抗体 GS3411 能使胶原降解后的空间构建发生变化，使得单核来源的巨噬细胞等分泌的 MMPs 更易发挥作用，加速和增强了胶原蛋白的降解，有效缓解肝纤维化和促进纤维化逆转。在肝脏中，基质刚度的升高可以激活HSCs或成纤维细胞，进而导致ECM的沉积，形成正反馈回路。所以有研究表明，抑制ROCK（Rho kinase）信号，靶向YAP（Yes1 associated ranscriptional regulator）或直接靶向α-SMA的表达等可以降低纤维组装，减轻肝纤维化。 

在纤维化进展过程中，非实质细胞，如肝间充质细胞，免疫细胞和内皮细胞是纤维化微环境的关键细胞组成部分，通过引发炎症等参与伤口愈合和组织修复，并调节HSCs转分化和调节ECM重塑来促进ECM的积累。免疫反应在纤维化疾病中起着重要作用，对免疫细胞以及其信号通路的系统研究仍然是开发新疗法的基础。

3.1 巨噬细胞具有双重作用

肝脏中含有大量组织驻留的巨噬细胞，称为库普弗细胞(KCs)，在生理和病理上可维持肝脏免疫稳态。库普弗细胞的激活和单核/巨噬细胞的募集是控制纤维化起始、持续和解决的关键事件。在损伤的肝脏中，巨噬细胞表型随炎症、纤维化的持续时间和程度而动态变化，具有较高的可塑性且具有异质性表型。肝巨噬细胞具有双重功能，如新鲜浸润的Ly-6C+ 单核细胞来源的巨噬细胞具有促炎表型，加重炎症。因此，使用抗CCl2或 CCR2（C-C motif chemokine receptor 2)的拮抗剂可以抑制对乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)给药后早期单核细胞浸润从而改善肝损伤，发挥抗纤维化作用。在非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)患者中，CCR2/CCR5 双抑制剂治疗可阻止单核细胞来源的巨噬细胞招募和星状细胞激活，并抑制纤维化。而在最近的两项Ⅱ期临床试验的报告中强调了这一概念，这些报告显示炎症信号的特异性抑制剂丝氨酸/ 苏氨酸激酶 ASK1 抑制剂 selonsertib和双 CCR2/CCR5 抑制剂cenicriviroc会靶向NASH和纤维化患者的巨噬细胞。

虽然这两种药物可能针对巨噬细胞的不同功能，但均具有抗纤维化作用。然而，一些肝纤维化的小鼠模型显示，肝巨噬细胞在纤维化的进展和消退过程中具有相反的功能。浸润单核/巨噬细胞也通过产生抗纤维化介质如 MMP12 和 MMP13 促进纤维化消退，或吞噬肝细胞碎片诱导Wnt3a(Wnt family member 3A)的表达而有利于实质再生CD11b(integrin subunit alpha M)双胎菌毒素受体转基因小鼠中巨噬细胞的选择性消耗能够阻止了慢性损伤后的纤维化发展，但它也能延缓损伤停止后的修复过程。并且巨噬细胞和HSCs双向调控，活化的HSCs有助于巨噬细胞表型改变为促炎症和促纤维化，而在HSCs中抑制 p38(p38kinase)可以消除这种巨噬细胞表型的变化，巨噬细胞浸润的消耗或阻断会减少星状细胞的活化和纤维化。所以浸润的单核/巨噬细胞可以环境依赖的方式具有促纤维化性和抗纤维化性。

3.2 其他免疫细胞

除此之外，中性粒细胞、适应性T细胞和B 细胞、NKT 细胞等免疫细胞在肝纤维化中同样起重要作用。中性粒细胞是一种先天免疫细胞，通常会加剧炎症从而促进纤维化的进展，但也有减轻肝脏炎症和纤维化的能力，在小鼠肝纤维化模型中通过MMP 的表达产生抗纤维化作用。适应性免疫系统中的T细胞和B细胞在慢性损伤的肝脏中都很丰富。B细胞已被鉴定为肝纤维化中的促纤维化细胞成分，可能通过调节HSCs-单核细胞的相互作用来调节早期纤维化。T细胞的贡献长期以来一直被Th1/Th2理论所解释，其中Th1和Th2细胞分别具有抗纤维化和促纤维化作用。NKT细胞也是肝损伤、修复、炎症和纤维化过程中免疫反应的中心组成部分，其在纤维化中的功能会受到不同背景的影响。在CCl4诱导的肝纤维化中，NKT缺陷小鼠更易发生肝纤维化；浸润的NKT细胞增加NKG2D配体的表达激活HSCs，改善肝纤维化。由此可见，免疫系统中免疫反应所在的微环境和细胞表型在肝纤维化的逆转中同样关键。

肝纤维化发生发展过程极其复杂，各种炎症，趋化因子的刺激不仅能够改变肝脏微环境，也通过不同的信号通路发挥作用。广泛研究的 TGF-β、YAP-TAZ 等通路均与肝纤维化密切相关。

在哺乳动物中，转化生长因子TGF-β具有TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3三种不同亚型，其分布具有细胞类型差异性，能够调节细胞凋亡、增殖、分化、迁移和侵袭等过程。TGF-β1 在健康和慢性损伤的肝脏中被广泛研究，并在多项临床研究中作为治疗靶点。YAP/TAZ通路在肝纤维化过程中的正调控和负调控存在相互矛盾的数据。Liu等的研究证明了维替泊芬抑制YAP可加剧肝纤维化。最近有研究表明，抑制YAP/TAZ信号可以减弱肝纤维化，如肝细胞特异性 YAP 和 YAP/TAZ 敲除可以减少纤维生成。

近年来，干细胞移植已成为一种有效的肝病治疗方法。鹿角干细胞(antler stem cells，ASCs)移植可有效减轻肝纤维化，抑制星状细胞的活化，减少脂肪变性，增加肝细胞再生，减少炎症，显著增强肝功能，并且 ASCs 具有易于获得、增殖能力高和体外扩增的优势。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)可促进肝细胞再生，增强肝功能，逆转肝纤维化。在肝细胞和LSECs中，自噬主要作为一种抗氧化和细胞保护机制保持细胞稳态 。LC3 相关吞噬作用 (LC3-associated hagocytosis，LAP)，是一种非典型的自噬形式，在啮齿动物慢性肝损伤期间防止肝脏和全身炎症，具有抗纤维化作用。自噬的促纤维化作用直接依赖于HSCs活化过程，自噬可以诱导肝纤维化中HSCs的激活和增殖，而用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)或特异性小干扰 RNA(siRNA)阻断自噬相关基因可减少HSCs激活，减轻纤维化程度。