Nature Commun：线粒体自噬途径相关的帕金森病潜在治疗靶标

导读:

    线粒体自噬（mitophagy）是细胞清除体内损伤线粒体和维持自身稳态的一种重要调节机制， Parkin所介导的线粒体自噬途径可从细胞中除去受损线粒体，该通路异常可导致受损线粒体日益积累，最终导致多巴胺能神经元的死亡，有早发性帕金森病（PD）的发生机制之一，但是其具体的机制以及以其作为靶点的相关研究尚未阐明。近日，多伦多大学G. Angus McQuibban研究团队在《Nature Communication》( IF=12.121 ) 期刊发表了题为“ROCK inhibitors upregulate the neuroprotective Parkin-mediated mitophagy pathway”的研究论文，报道了ROCK可以作为Parkin介导的线粒体自噬通路的分子开关，应用ROCK抑制剂可增强Parkin介导的线粒体自噬，从而改善体内PD的相关表型，有望被开发用于靶向治疗帕金森病。

几种ROCK抑制剂增加Parkin募集到受损线粒体

   线粒体损伤后，PINK1稳定在线粒体外膜上，通过介导磷酸化使得Parkin从胞浆向线粒体募集。随后，Parkin通过标记泛素来指定蛋白酶体或自噬降解的底物。针对该机制，作者开发了一种高通量的小分子筛选，应用CCCP诱导线粒体自噬后，对Parkin在受损线粒体中的募集进行量化，以确定Parkin介导的线粒体自噬的上游调节因子。作者已确定一些Parkin的调控因子，包括TOMM7、HspA1L、BAG4、SIAH3、ATPIF1和HK2。但是，在线粒体自噬级联中改变Parkin募集过程的小分子还有待进一步鉴定。

    作者将平均值大于80%的小分子作为候选的靶点，而平均值低于50%则视为抑制剂；为了最大限度地提高恢复真阳性的几率，还根据共同的蛋白质靶标排列Parkin招募增强子。由于在FGFR、ROCK和MEK抑制剂中Parkin募集值最高，其中ROCK抑制剂系列的恢复率又是最高，因此，在后续研究中，作者选择了两种效应最强的ROCK抑制剂Y27632和Y39983，以及另外一种更具选择性的ROCK2抑制剂SR3677。CCCP诱导2小时，SR3677孵育16h后，可见损伤线粒体的Parkin募集增加。

图1. ROCK抑制剂增加Parkin募集到受损线粒体

ROCK抑制剂在线粒体自噬级联反应中的几个步骤促进线粒体自噬

     既往研究表明ROCK抑制在神经退行性变疾病模型中发挥保护作用，包括PD。然而，ROCK在Parkin介导的线粒体自噬通路中的作用尚未被探讨。图2可见，与Ac220相比，Y39983，SR3677增加了Mfn2的降解。由于ROCK2在神经系统中富集，SR3677对ROCK2更高的选择性可能具有治疗优势，因此，随后的验证实验主要关注SR3677。实验结果提示，SR3677增加了另一种线粒体外膜Parkin底物VDAC1的周转。另外，还定量了表达GFP-Parkin和mito-DsRed的HeLa细胞的线粒体质量，其中DsRed是针对线粒体基质的。虽然DMSO和SR3677处理的细胞在DMSO处理24小时后仍保留线粒体质量，但CCCP处理24小时后，经DMSO预处理的细胞中有47.5±8.25%的细胞保留了线粒体，而SR3677预处理的细胞只有28±8.21%。由此可见，SR3677可促进各个亚线粒体组分中的蛋白质降解。

图2. 线粒体被诱导损伤后，SR3677减少线粒体质量

   应用mito-QC法测定受损线粒体对溶酶体的靶向性，细胞经SR3677预处理后，线粒体靶向溶酶体增加，诱导线粒体自噬。重要的是，SR3677本身增强但却不诱导线粒体自噬。mitoQC分析也可以在果蝇身上进行，发现mitoQC基因在果蝇脑内多巴胺能神经元簇中表达。而且，SR3677和百草枯(PQ)共处理组（SR+PQ）中，单红色线粒体信号占总线粒体信号的百分比大于对照组（H2O）。以上结果表明SR3677 可增加线粒体对溶酶体的靶向作用。

图3. SR3677 增加了线粒体对溶酶体的靶向作用

SR3677通过抑制其典型靶点ROCK2以促进线粒体自噬

   建立稳定表达shRNA的细胞株，并通过western blotting验证ROCK2的敲除。发现Parkin募集在ROCK2敲除细胞中增加，而在转染Flag-ROCK2细胞中减少，提示ROCK2对Parkin募集起负调控作用。

图4.ROCK2水平的基因操作模拟SR3677介导的ROCK2抑制的效应

HK2是Parkin的正调控因子，有研究提出Akt介导的HK2活化需要Parkin募集到受损的线粒体；同时，HK2过表达可增加Parkin募集。由于HK2是Parkin底物，于是使用缺乏内源性Parkin的HeLa细胞，发现SR3677处理后可使HK2在线粒体中分布增多。此外，经SR3677处理后，在线粒体组中HK2表达量明显高于总细胞组和胞质组。最后，ROCK抑制剂处理后观察到HK2磷酸化增加。这些结果表明SR3677增加了HK2的活性和线粒体定位。通过这一机制，有可能在不降低细胞活力的情况下，实现上调Parkin介导的线粒体自噬。

图5. SR3677激活HK2并增加其在线粒体的丰度

SR3677在体内的神经保护作用具有帕金森和rok依赖性 

作者继续在体内验证 SR3677的功能。首先，明确SR3677是否影响果蝇的生存能力：单独应用SR3677不影响果蝇存活，但是百草枯诱导线粒体损伤后，再应用SR3677可提高遭受帕金森毒素攻击的果蝇存活率。当编码Pink1和parkin基因发生突变可导致线粒体膜电位去极化，线粒体活性氧增加，可表现为攀爬、存活能力受损等；经百草枯处理后，果蝇表现出相似的表型，这可能是线粒体功能紊乱的结果。于是，进一步验证在神经元中观察到的效应是否可以在更复杂的果蝇PD模型中重现： 百草枯可减弱果蝇攀爬能力，而SR3677可抵消百草枯对果蝇造成的损伤，恢复果蝇攀爬能力。随后，继续验证ROCK抑制剂治疗后，神经保护作用是否依赖于Parkin介导的线粒体自噬途径。将酪氨酸羟化酶(TH)-GAL4果蝇与转基因UAS-parkRNAi果蝇杂交，特异性敲除果蝇多巴胺能神经元中的Parkin，发现：在TH-GAL4中果蝇的攀爬能力无明显改善；SR3677的神经保护作用具有剂量依赖性，而且依赖于rok。

图6. SR3677改善了由遗传和化学线粒体功能障碍引起的存活和攀爬损伤 

结 论

 该研究认为ROCK是Parkin介导的线粒体自噬途径的关键调控因子，一方面明确了ROCK抑制剂可通过促进Parkin正调控因子HK2向线粒体募集，从而增强线粒体对溶酶体的靶向性，有效清除细胞中受损的线粒体；另一方面还提出了ROCK抑制剂对百草枯（PQ）诱导的线粒体受损果蝇具有神经保护作用，且该保护机制依赖于Parkin和rok，由此揭示了一条可调控Parkin介导的线粒体自噬的信号轴，有助于帕金森病治疗开辟新思路。