Nat Neurosci：是痛还是怕痛？刘圣等发现消除恐惧记忆或是治疗慢性疼痛的重要方向

慢性疼痛会导致终身的疼痛敏化，而恐惧记忆可能对此有所影响。近日，德国海德堡大学药理中心Rohini Kuner团队研究发现，大脑前额叶皮层中的一小部分神经元可以调节长期恐惧记忆和疼痛感知之间的相互作用。由于事前的痛苦经历往往会在未来重新激活恐惧记忆，他们发现，通过单独抑制恐惧记忆的印迹可以减轻强直性疼痛和慢性疼痛中的超敏反应。

他们的成果发表在最新一期的Nature Neuroscience杂志上，名为 “Prefrontal engrams of long-term fear memory perpetuate pain perception”。来自遵义医科大学附属医院的刘圣博士为此文的共同第一作者。

在同期新闻与评论栏目中，来自法国巴黎文理研究大学的Gisella Vetere团队对此文进行了题为“Fear memory engram is the mind-killer”的精彩评论。

疼痛和恐惧是两个相对独立的感知过程，但事实上在某些情况下是相互关联且密不可分的。例如，当我们面临危险时，突然的恐惧会暂时抑制疼觉——比如面对威胁时，这是一种众所周知的生理机制。然而，事前疼痛所致的长期恐惧记忆则会在未来增加慢性疼痛患者对疼痛的敏感度，其具有重要的临床意义。尽管恐惧介导的急性镇痛已得到充分证明并解释了其机制，但对长期恐惧记忆对疼痛的影响知之甚少。此文通过标记和操纵记忆印迹（engram）研究了长期恐惧记忆与疼痛感知之间的关系，其中，印迹是指大脑中记忆的物理痕迹，在细胞层面上，被认为是行使长期记忆存储功能的细胞群体。当事件发生时，这些细胞会被激活，并经历必要的可塑性变化；当回忆同一事件时，这些细胞会再次被招募并响应。在此研究中，Rohini Kuner团队通过几个关键实验研究了这一有趣的相互作用。

首先，作者针对人类内侧前额叶皮层（mPFC）的小鼠同源物——前边缘皮层（PL，Prelimbic）进行了研究，因为这一脑区为长期记忆储存的关键脑区，并且同时与疼痛高度相关，作者推断其为两者的重要枢纽。于是，作者使用了一个名为“Tet-Off” 的成熟标记系统，特异性标记了在特定时间活跃的神经元细胞子集（例如，恐惧印迹细胞或对疼痛反应的细胞）。简而言之，通过AAV病毒载体，他们把两套基因系统同时整合到小鼠PL脑区的神经元中。其中一套系统中，上游神经元激活标志物 c-fos 基因的表达可促使另一套系统中报告蛋白和功能蛋白的表达（如报告蛋白mCherry, 或者光遗传激活蛋白ChR2， 抑制蛋白ArchT），而多西环素（Doxycycline）可阻断这两套系统的联系。通过控制小鼠食物中的多西环素，就可以打开或者关闭神经元标记的时间窗口，从而在特定时间内标记特异活动的神经元群体。

自实验伊始，小鼠一直被给予含有多西环素的食物或水；通过在恐惧回忆期间更换为普通食物，可以打开时间窗口并通过恐惧回忆标记下恐惧记忆印迹（mCherry作为报告蛋白）。随后，当再次给予含有多西环素的食物或水后，时间窗口关闭，则通过注射辣椒素对强直疼痛期间表达 c-Fos 蛋白的细胞进行免疫荧光染色，继而另外标记对疼痛反应的神经元。荧光细胞计数的结果显示这两个群体之间存在强烈而显着的重叠，而同一 PL细胞在这两种行为中的电生理记录也同样证实了存在这种重叠。这意味着，PL中一小群神经元不仅编码恐惧记忆，同时又被疼痛反应所招募。

图1. Tet-off方法及恐惧印迹与疼痛反应细胞在PL中的重叠。

图2. PL神经元恐惧与疼痛行为的电生理记录

作者观察到的这种恐惧记忆与疼痛之间的重叠非常有趣。为了检验这种长期恐惧记忆对疼痛感知的影响，他们将报告蛋白改为了光遗传抑制性蛋白（ArchT）或兴奋性蛋白（ChR2）。这样，就可以在随后的强直性疼痛刺激期间操纵这些细胞群体。不出所料，光遗传学抑制长期恐惧记忆印迹时，小鼠减少了辣椒素注射后强制性疼痛行为。相反，当激活长期记忆印迹时，小鼠会增加强制性疼痛相关行为。而这些结果是长期恐惧印迹所特有的，因为当以随机的PL细胞群（将c-fos换为了Synapsin）作为抑制或激活的目标时，并没有观察到小鼠疼痛行为上的改变。

图3. 长期恐惧记忆印迹的光遗传学抑制与激活。

而更有趣的一个点在于，恐惧本身也会分为先天的恐惧与后天形成的恐惧。作者通过同样的Tet-off方法，将小鼠暴露在 TMT中（一种小鼠的天敌——狐狸的尿液和粪便中存在的气味)，从而标记出先天的恐惧印迹。有趣的是，在这种情况下，与激活先前的远程恐惧记忆相比，激活先天的恐惧印迹反而抑制了疼痛。这种明显对比可能隐藏了一个更复杂的生理机制——当动物面临威胁的时候，中枢会产生对疼痛的暂时抑制，更有利于躲避、逃跑或攻击。该实验还证实，印迹操作对疼痛相关行为的影响特定于长期恐惧记忆印迹。此外，作者尝试用与疼痛无关的噪声回避（焦虑）或水奖励训练（学习）来代替强直性疼痛时，恐惧印迹的抑制均未能改变小鼠的行为，表明长期恐惧印迹只会特异性的影响与疼痛直接相关的行为。

图4. 长期恐惧记忆和疼痛之间相互作用的特异性。

临床研究表明，患有慢性疼痛的患者对非疼痛刺激具有极度的病理敏感性——疼觉过敏。由于恐惧记忆或者认知会加剧这种痛觉过敏，因此作者想知道对恐惧印迹操纵是否会改变损伤引起的慢性疼痛的敏感性。首先，他们通过一个简单的实验观察到了一个有趣的现象：已建立长期恐惧的小鼠通过SNI手术诱发慢性神经病理性疼痛后，小鼠的非损伤侧有显著提高的超敏反应。

同样，在注射完全弗氏佐剂CFA的小鼠中也观察到了同样的现象。而在PL中，慢性疼痛模型小鼠的“恐惧-疼痛”重叠细胞也更多。而更有趣的是，恐惧和触觉表征之间的重叠并不局限于小鼠PL的微网络，而是扩展到了整个大脑。作者通过在触觉刺激期间使用 Tet-Off来捕捉触觉反应细胞的投射，并同恐惧印迹细胞的投射进行了比较。在对照小鼠中，这两个群体都投射到非常不同的网络中。而在恐惧条件反射刺激和 SNI 诱导的慢性疼痛之后，触觉反应细胞的投射发生了强烈的变化并匹配恐惧记忆网络，包括一些与恐惧相关的关键枢纽区域，例如杏仁核、岛叶皮层、内侧丘脑和前扣带皮层等。这些发现表明，在慢性疼痛中，恐惧相关的网络会可塑性的扩展到触觉相关的细胞网络。

图5.  恐惧记忆、痛觉和触觉在炎症和神经性疼痛中可塑性。

考虑到在慢性疼痛条件下触觉与疼痛反应相关细胞与恐惧记忆网络的这种关系，是否有可能通过抑制长期恐惧记忆印迹从而缓解慢性疼痛？作者在SNI或CFA诱导的慢性疼痛的小鼠中对长期恐惧记忆印迹细胞进行了Tet-Off标记和光遗传抑制，结果慢性疼痛发生后几天和几周的痛觉超敏反应都明显降低了。

图 6. 抑制长期恐惧记忆可降低炎症性疼痛和神经性疼痛中已建立的痛觉超敏反应。

这种光遗传学抑制的限制在于，其只能暂时降低疼痛超敏反应，这样的抑制并不可持续。这让我们想知道恐惧记忆是否可以被彻底“消除”。换句话说，是否可以在慢性疼痛状态中已经重叠的恐惧和疼痛网络分离开，以实现对慢性疼痛的根除或持久的治疗效果？

必要时，我们可以在危险的紧急时刻暂时抑制疼痛，而其所涉及的机制是快速诱导并且短暂的。而相反的，长期恐惧记忆会导致伤害感受终身的增强。本文表明，恐惧反应细胞不仅能够变成疼痛反应细胞，而且在慢性疼痛模型中，面临恐惧时会导致整个大脑对疼痛或者触觉反应细胞的连接性发生可塑性变化。

该研究探索了疼痛和长期恐惧记忆之间的这些机制，发现前额叶皮质神经元的恐惧记忆可以加剧疼痛感知，同时沉默这些神经元可以抑制疼痛和病理性超敏反应。其结果表明，消除长期恐惧记忆是治疗慢性疼痛的重要方法，并为针对慢性疼痛和共病恐惧患者针对前额回路的治疗提供了动力，有望引发新的疼痛治疗策略和干预措施。