PNAS：北京大学谢晓亮团队开发新型单细胞甲基化与羟甲基化测序技术

现有的基于亚硫酸氢盐的单细胞DNA甲基化分析受限于较低的DNA回收率，单碱基分辨率下5hmC的测量仍然具有挑战性。

2023年11月27日，北京大学谢晓亮团队（曹云龙、白雅丽及袁天骄为文章的共同第一作者）在PNAS 上在线发表题为“Single-cell bisulfite-free 5mC and 5hmC sequencing with high sensitivity and scalability”的研究论文，该研究提出了一种无亚硫酸氢盐的单细胞全基因组5mC和5hmC分析技术，命名为Cabernet，它可以在高基因组覆盖率下以单碱基分辨率表征5mC和5hmC。Cabernet利用Tn5转座子进行DNA片段化，能够区分不同的等位基因以测量半甲基化状态。

该研究利用Cabernet揭示了小鼠早期胚胎发育过程中5mC、hemi-5mC和5hmC的动态变化及其受主动或被动去甲基化调控的基因组区域，证明了半甲基化状态可以用来区分复制前和复制后的细胞，且当与5mC谱整合时可以实现更有效的细胞分组。此外，研究者们在小鼠皮层神经元和胚胎7.5天( E7.5 )胚胎中进行了探索，并以较高的效率构建了成千上万个单细胞的文库，证明了其在低成本分析复杂组织方面的潜力。总之，该研究提出了一种在单细胞分辨率下高通量甲基组和羟甲基组检测的方法，使神经元和癌细胞等具有复杂性质的生物系统的表观遗传状态得以有效分析。

在哺乳动物中，DNA甲基化多以5 -甲基胞嘧啶( 5mC )的形式出现在CpG二核苷酸上，在基因调控、细胞发育和疾病形成中起着至关重要的作用。单细胞DNA甲基化测序是揭示细胞异质性和研究早期胚胎发育等稀有样本所必需的。然而，亚硫酸氢盐测序( bisulfite sequencing，BS-seq )，作为定位哺乳动物DNA甲基化的金标准，涉及一种苛刻的化学反应，可降解大部分双链DNA ( double-stranded DNA，dsDNA )，从而导致相当大的信息丢失。尽管存在巨大的DNA损失，亚硫酸氢盐依赖的单细胞甲基化测序已经被应用于生物学研究。例如，基于简化基因组重亚硫酸盐测序( Reduced Representation Bisulfite sequencing，RRBS )的单细胞甲基化组测序方法被开发并应用于小鼠早期胚胎的甲基化研究。然而，这种方法可以覆盖CpG密度较高的区域，并获得低于5 %的基因组覆盖率。

为了实现全基因组甲基化测序，其他方法如scBS-seq和scWGBS等都是基于PBAT ( post-bisulfite adaptor labeling )策略，通过随机引物法合成DNA。然而，多轮随机启动旨在实现最大程度的dsDNA回收，会引入引物二聚体和串联体，导致作图效率较低。后来报道的snmC-seq和snmC-seq2方法通过结合随机引物和接头反应，改进了read mapping。尽管如此，这些方法仍然涉及苛刻的亚硫酸氢盐处理，降解了大部分的DNA，限制了整个基因组的覆盖率。在单细胞和单碱基分辨率下的高效全基因组甲基化检测方法备受青睐。然而，要开发这种方法，有几个问题需要解决。

首先，应避免亚硫酸氢盐处理引起的DNA损伤，为此提出了几种不含亚硫酸氢盐的甲基化组测序技术。TET辅助吡啶硼烷测序( TAPS )是利用TET氧化偶联吡啶硼烷还原，将修饰的胞嘧啶转化为二氢尿嘧啶( DHU )。酶切甲基测序( EM-seq )结合了TET2和BGT对5mC和5 -羟甲基胞嘧啶( 5hmC )的保护，APOBEC将C脱氨为U。虽然这些方法可以通过避免亚硫酸氢盐处理来更好地保存DNA，但这些方法中涉及的多个纯化步骤导致DNA在处理过程中大量损失，限制了它们在单细胞场景中的应用。同样，基于亲和富集的5hmC分析技术，如5hmC-DIP和hMe-Seal，也无法实现单碱基分辨率。后来报道的TAB-seq、oxBS-seq和ACE-seq方法，由于复杂的工作流程和多个纯化步骤，都需要较高的DNA输入，限制了它们在单细胞中的应用。为了揭示全基因组范围内细胞群体中的5mC和5hmC异质性，在单细胞水平和单碱基分辨率上具有最小DNA损失的无亚硫酸氢盐的DNA修饰谱方法是首选的。

工作流程和验证（图源自PNAS）

其次，表征复杂组织中细胞类型特异性的甲基化状态需要可扩展的基于单细胞的测序技术。目前建立的单细胞测序方法，每个单细胞在单个制备中进行处理，劳动强度大。虽然暴力策略的应用可以在一定程度上帮助扩大规模，但正如snmC - seq一样，它仍然是一种费力的方法，因为每生产一个细胞都需要一个单独的反应。另一方面，sci - MET解决了这一问题，利用多阶段索引标记数千个单细胞用于混合文库制备，实现了高通量的5mC分析。在组合索引过程中使用条形码Tn5转座体是该方法实现高通量的关键步骤；然而，亚硫酸氢盐处理的使用限制了Tn5的作用，需要后续的随机引发。然而，尽管该方法具有很高的可扩展性，但由于亚硫酸氢盐的转化，导致基因组覆盖率非常低。因此，需要一种提高DNA覆盖率的高通量单细胞甲基化测序方法。

为了应对这些挑战，该研究开发了一种基于EM-seq的方法，命名为Cabernet (带末端标签的酶促反应载体辅助的碱基转换)。与亚硫酸氢盐处理不同，赤霞珠依赖酶法转化，其中5mC和5hmC通过TET氧化和BGT介导的糖基化转化为5gmC，C通过APOBEC介导的脱氨基转化为尿嘧啶，遵循EM - seq方案。重要的是，Cabernet利用载体DNA来减少纯化过程中的DNA损失，并通过使用Tn5转座体来实现可扩展性。总而言之，该技术能够在单细胞和单碱基分辨率下高通量检测全甲基化组和羟甲基化组，具有较高的基因组覆盖率。

参考信息：

https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2310367120.