自噬与miRNA：国自然两大热点相结合，带你搭上高分文章的便车！

自从2016 年日本细胞生物学家大隅良典因其在阐明细胞自噬的分子机制和生理功能上的开拓性研究获得诺贝尔奖以来，自噬引起了众多科研工作者的广泛关注，成为当前生命科学/基础医学研究的一大热点。近年来，以细胞自噬为研究对象的高分文章不断涌现，也成为国家自然科学基金的资助项目中炙手可热的研究领域。不可否认，近几年国自然主要还是更支持基础研究，那非编码RNA就是基础研究中最最入门的套路了，包括：microRNA、lncRNA、circRNA 以及 ceRNA 的机制相关研究。今天就带大家探究如何将miRNA与细胞自噬结合发14分+文章。

一、研究背景

病理性心肌肥厚是心功能不全和心力衰竭的重要基础。近年来，越来越多的证据证实，心肌细胞中的自噬在调节心血管疾病中起着关键作用。自噬的抑制会引起心肌肥大，自噬的适度激活可以保护心脏免受最初的心脏肥大进展，而过度自噬也会对心脏稳态产生恶化影响。

越来越多的证据表明，microRNA (miRNA) 在生物过程中发挥多种作用并参与心血管疾病。一些 miRNA 可作为心血管疾病的生物标志物。此外，miRNA 参与介导心脏肥大和心力衰竭的过程，循环 miRNA 被提议作为心力衰竭的潜在诊断和预后生物标志物。在本研究中，作者研究了 miRNA-34c-5p 对心肌肥厚的影响及其机制。

二、研究思路

1.建立体内外心肌肥厚模型

2.体外实验：miR-34c-5p促进NRCMs的肥厚反应→自噬与miR-34c-5p介导的心肌肥厚有关→miR-34c-5p抑制自噬通量→ATG4B是miR-34c-5p的靶点→ATG4B参与miR-34c-5p介导的心肌肥厚

3.体内实验：过表达miR-34c-5p促进心肌肥厚→抑制miR-34c-5p能够抑制ISO诱导的心肌肥厚

三、研究方法及结果

1.ISO诱导心肌肥厚并增加miRNA-34c-5p的表达

心脏形态学检查、PSR染色、HE染色 、WGA染色和代表性超声心动图显示为典型的肥厚性改变，包括心肌细胞外基质胶原沉积和炎症细胞浸润。使用 ISO治疗还增加了心脏重量与体重（HW/BW）和心脏重量与胫骨长（HW/TL）的比值。并通过升高EF、FS、LVPW和IVS而诱发心脏结构和功能异常。ISO灌注小鼠心肌组织中肥大标志物ANF和b-MHC的蛋白和mRNA水平显著升高。在培养的NRCMs中，ISO刺激(10mmol/L24小时)也导致ANF和b-MHC表达显著升高。这些结果表明，ISO在体内和体外均成功地诱导了心肌肥厚。

2.MiR-34c-5p 促进 NRCM 的肥大反应

为了进一步研究 miR-34c-5p 在心肌细胞中的功能，作者进行了gain-of-function和loss-of-function两种方法。分别用 miR-34c-5p mimic、阴性对照mimic（NC mimic）、miR-34c-5p 抑制剂和阴性对照抑制剂（NC 抑制剂）转染NRCM。结果发现，与 NC mimic组相比，转染 miR-34c-5p mimic的 NRCM 中心肌肥大标志物 ANF 和β -MHC 的水平显着增加。

miR-34c-5p 过表达也增加了平均细胞表面积，与 ISO 刺激效果一致。此外，ISO诱导肥大反应，例如β -MHC 和 ANF 表达上调以及细胞表面积扩大，这可以被 miR-34c-5p 抑制剂减弱。总之，这些结果表明 miR-34c-5p 足以在体外诱导心肌细胞肥大，而 miR-34c-5p 抑制可以成功抑制 ISO 诱导的 NRCM 中的肥大反应。

3.自噬与 miR-34c-5p 介导的心脏肥大有关

上述实验结果表明，miR-34c-5p参与了心脏肥大的发展。然而，miR-34c-5p 介导心脏肥大的机制仍不清楚。作者之前研究表明，在 ISO 诱导的心脏肥大中，自噬显着减少，心肌细胞中的自噬抑制会引起心脏肥大。本项目作者检测了 LC3（酵母 Atg8 的哺乳动物同源物）和 P62 表达的水平，以确定自噬的变化。结果发现，自噬的底物 P62 蛋白的水平与自噬活性呈负相关。此外，还检测到从胞质形式的 LC3 (LC3-I) 向 LC3-II 的转化，这是自噬体形成和自噬激活的重要过程。作者观察到用 miR-34c-5p mimic刺激后 P62 表达升高，LC3-II 表达被抑制，而 miR-34c-5p 抑制剂显示相反的作用，表明 miR-34c-5p 可以调节自噬活性。

3-MA 和雷帕霉素用于验证自噬在 miR-34c-5p 介导的心脏肥大中的作用。结果发现，3-MA可以显著提高NRCM 中的细胞表面积以及肥大标志物 ANF 和β -MHC 的表达。相反，雷帕霉素是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 (mTOR) 的特异性抑制剂，已被广泛用于诱导自噬。雷帕霉素治疗显着减弱了 NRCM 中 ISO 刺激的肥大反应。雷帕霉素还减轻了 miR-34c-5p mimic诱导的肥大反应，并导致肥大标志物 ANF 和β -MHC 的表达升高和细胞表面积增大，而 3-MA 消除了 miR-34c-5p 抑制剂的抗肥大反应。这些结果表明自噬与 miR-34c-5p 介导的心脏肥大密切相关。

4.MiR-34c-5p 抑制自噬通量

为了确定 miR-34c-5p 对自噬动态过程的影响，作者分析了自噬通量的变化。CQ 是一种成熟的自噬抑制剂，可以抑制溶酶体酸化，从而防止自噬体融合和降解。Baf A1也广泛用于分析自噬通量。作者发现，单独的 miR-34c-5p mimic可以下调 NRCM 中的 LC3-II 水平。CQ 处理导致 LC3-II 的积累，这种积累可被 miR-34c-5p mimic所逆转。给予Baf A1也发现了类似的结果。这些数据表明 miR-34c-5p mimic抑制了 LC3-II 的形成，从而在自噬通量被溶酶体抑制阻断时导致更少的 LC3-II 聚集。

相反，在用 CQ 或 Baf A1 处理的细胞中，与 NC 抑制剂相比，miR-34c-5p 抑制剂仍可以促进 LC3-II 水平，这表明 miR-34c-5p 抑制通过增强 LC3-II 形成来促进自噬。此外，CQ 导致 P62 的积累，在 miR-34c-5p 模拟物的存在下进一步增加。用 ISO 或 miR-34c-5p mimic刺激的细胞在细胞质中表现出减少的 LC3 聚集，而用 miR-34c-5p 抑制剂处理的细胞表现出增加的 LC3 聚集。在用 GFP-LC3 质粒转染的 NRCM 中，作者发现 miR-34c-5p 模拟物有效地降低了 GFP-LC3 puncta和解离的 GFP 蛋白表达。相比之下，miR-34c-5p 抑制剂明显诱导 GFP-LC3 puncta和解离的 GFP 蛋白表达。

之后，作者用具有 mCherry-GFP-LC3 融合蛋白的腺病毒用于感染 NRCM。在正常情况下，LC3 定位于自噬体发出黄色信号（mCherry 和 GFP），自噬体与溶酶体融合后，自噬体呈现稳定的 mCherry 红色斑点，因为对酸敏感的 GFP 被低溶酶体 pH 37更快地淬灭。自噬体诱导会导致绿色斑点和红色斑点的增加，随后增强的自噬体与溶酶体的结合可以增加仅红色斑点的数量。结果发现，用 miR-34c-5p 模拟物处理后，黄点和仅红点均显着减少，表明自噬过程受阻。然而，miR-34c-5p抑制剂以时间依赖性方式明显促进黄点和仅红点的形成。这些数据表明 miR-34c-5p 可以抑制自噬通量，而抑制 miR-34c-5p 促进自噬的诱导。

5.ATG4B是miR-34c-5p的直接靶标

为了阐明 miR-34c-5p 在调节心肌肥厚中的分子机制，作者使用生物信息学预测到具有保守 miR-34c-5p 结合位点的转录物。 之前已阐明 miR-34c-5p 显着影响自噬活性，有趣的是，自噬相关基因Atg4b和Atg9a通常被 TargetScan 和 miRDB 预测为 miR-34c-5p 的靶标。大鼠Atg4b 3' UTR 与 miR-34c-5p 的预测结合位点在人和小鼠中高度保守。用编码 Atg4b 的 WT-3' UTR 或Atg4b 3' UTR内的突变 miR-34c-5p 结合位点的pEZX -MT06 双荧光素酶载体转染 HEK293T 细胞。结果表明，与 NC mimic相比，WT- Atg4b -3' UTR 荧光素酶载体与 miR-34c-5p mimic组共转染后，归一化的荧光素酶活性有效降低。Atg4b 3' UTR中 miR-34c-p 结合位点的突变消除了 miR-34c-5p 模拟物的抑制作用。在 NRCM 中，miR-34c-5p mimic降低了 ATG4B 的表达，而用 miR-34c-5p抑制剂治疗提高了 ATG4B 蛋白水平。这些结果验证了ATG4B是miR-34c-5p的直接靶标。

6.ATG4B 参与 miR-34c-5p 介导的心肌肥厚

为了进一步确定 ATG4B 在 miR-34c-5p 调节的心脏肥大中的作用，将 NRCM 与 miR-34c-5p 抑制剂和Atg4b siRNA 共转染。结果表明，ISO 处理引起心肌细胞肥大，但被 miR-34c-5p 抑制剂所逆转。然而，miR-34c-5p 抑制的保护作用被Atg4b沉默所抵消。接下来，用 miR-34c-5p 模拟物和编码 Atg4b 的表达载体共转染NRCM。Atg4b的过表达减弱了 miR-34c-5p 模拟触发的肥厚标志物表达和细胞表面积的增加。这些发现共同表明 ATG4B 参与了 miR-34c-5p 介导的心肌细胞肥厚。

7.miR-34c-5p 的过表达促进体内心脏肥厚

鉴于在使用培养的 NRCM 进行的功能获得研究中观察到的促肥大反应，作者假设特定 agomir 过表达的 miR-34c-5p 可能促进体内心肌肥厚的发展。qRT-PCR 分析证明，在尾静脉注射 miR-34c agomir的小鼠中，内源性心脏 miR-34c-5p 水平成功升高，但在接受阴性对照agomir的小鼠中没有此类改变。ISO 处理和 miR-34c agomir 可诱导明显的肥大异常，包括心脏增大、心肌结构紊乱、细胞间隙缩小以及 HE 和 PSR 染色检测到明显的胶原沉积。此外，使用 ISO 或 miR-34c-5p agomir 后，HW/BW 和 HW/TL 比值以及超声心动图参数（如 EF、FS 和 LVPW）显着升高，而 LVID 和 LV Vol 降低。此外，还检测了 ATG4B、自噬标志物和肥大标志物的蛋白质和 mRNA 水平。数据显示 miR-34c-5p agomir 提高了 ANF、β -MHC 和 P62 的水平，但降低了 ATG4B 和 LC3-II 的水平。这些结果表明miR-34c-5p抑制ATG4B表达和自噬活性，从而诱导小鼠心脏肥大。

8.抑制 miR-34c-5p 可挽救 ISO 诱导的小鼠心脏肥大

作者接下来探讨了 miR-34c-5p antagomir 是否可以抵消 ISO 诱导的动物肥大异常。通过 qRT-PCR 测定，在用 miR-34c-5p antagomir 处理的小鼠心脏组织中成功降低了 miR-34c-5p 表达水平。形态学和组织学分析表明，miR-34c antagomir 减弱了 ISO 引起的肥大反应和相关的病理变化。Antagomir 给药抑制了 ISO 刺激的 HW/BW 和 HW/TL 比率的增加。它还通过使 EF、FS、LVPW、LVID 和 LV Vol 水平正常化来改善 ISO 引起的心脏结构和功能异常。此外，输注 ISO 后心脏组织中 ATG4B 和 LC3-II 的含量增加，而 P62 和肥大标志物的水平被 miR-34c-5p antagomir 减弱。这些结果表明，抑制 miR-34c-5p 可以增加其靶标 ATG4B 的水平，从而增加自噬活性并保护小鼠免受 ISO 诱导的心脏肥大。

四、总结

在本研究中，miRNA-34c-5通过靶向ATG4B调节自噬在ISO诱导的心肌肥厚发挥重要作用，且miR-34c-5p的调节可能是治疗心肌肥厚的潜在策略。文章的亮点在于进行了生物信息学分析，并预测ATG4B为miR-34c-5p的下游效应因子。通过分离自噬过程精准定位到miR-34c-5p抑制自噬通量整体变化。不足之处本文章仍然排除除ATG4B外的其他靶点可能参与miR-34c-5p的促肥厚作用。可以增加心脏特异性ATG4B过表达或缺失的动物来观察心肌肥大现象可以进一步验证实验结果。