基于转录组学和蛋白质组学的高海拔肺动脉高压大鼠模型的新靶点

肺动脉高压（PH）是指静息时平均肺动脉压≥25 mmHg。 它根据血流动力学特征、发病机制和病理学分为五类。 第三类高海拔肺动脉高压（HAPH）是由于在高海拔缺氧环境中肺换气量代偿性增加和肺小动脉血管收缩引起的，导致高原心肌病。 临床症状包括运动性呼吸困难、头痛和疲劳。 HAPH 可能反映了未能适应高海拔，并伴有不清楚的病理生理机制。 大约有 1.4 亿人生活在海拔 2,500 米以上的地区，每年有超过 4,000 万人访问这些高海拔地区。 缺氧导致器官基因表达谱发生差异变化； 这是从长期居住在高海拔地区的居民及其后代的基因型适应性变化中得知的。HAPH 的治疗仍在研究中。应建议患者移至低海拔地区，氧疗有效。药物治疗的研究仅限于一些随机试验。 HAPH 的病理与其他类型的 PH 相似，因此值得考虑对 PAH 有效的药物是否对 HAPH 有效。

然而，所有这些靶向药物都在HAPH中的有效性和机制尚不清楚。为了解决这个问题，我们旨在研究缺氧所涉及的分子机制，使用大鼠 HAPH 模型，并应用综合多组学方法。 在此过程中，我们旨在研究几种靶向药物和复氧的作用，以确定高海拔引起的缺氧的潜在新治疗靶点。 特别是，我们研究了靶向药物如何影响器官之间的差异基因和蛋白质表达。

研究设计：

将大鼠置于 10% O2（缺氧）室中 3 周以产生 PH。对照大鼠（C 组）在整个实验中都处于常氧环境下，并在治疗期间（即从第 21 天开始）用载体进行治疗。 3周时，其余大鼠随机分为六组；一组被处死（第 21 天）以评估心肺功能。其余 5 组用靶向药物或复氧治疗，从第 21 天到第 35 天处死。慢性缺氧，载体处理（M）；慢性缺氧，司来帕格治疗；慢性缺氧，马西替坦治疗；慢性缺氧，riociguat 治疗；慢性缺氧、复氧 (RE)。

转录组分析：

提取总 RNA，并通过使用 Arraystar rRNA Removal Kit 去除 rRNA 来富集 mRNA 和非编码 RNA。 mRNA 和非编码 RNA 被片段化缓冲液分解成短片段（~200-500 nt）。以短片段为模板，利用随机六聚体引物合成第一链cDNA。在第二链合成过程中，dTTP 被 dUTP 取代。 然后加入洗脱缓冲液以通过末端修复和添加腺嘌呤来纯化和分离短片段。 短片段被纯化并与接头连接； 使用尿嘧啶-N-糖基化酶消化第二条链。 琼脂糖凝胶电泳后，选择合适的片段作为模板进行PCR扩增。 使用 Agilent 2100 生物分析仪和 ABI StepOnePlus 实时 PCR 系统对样品库进行定量和质量评估。 该文库使用 Illumina HiSeq 2000 系统进行测序。

LC-MS/MS 分析

在连接到 Easy-nLC 1000 液相色谱系统的Q Exactive HF 质谱仪上分析样品。将干燥的肽样品重新溶解在溶剂 A（0.1% 甲酸水溶液）中并加载到捕集柱中使用溶剂 A 的最大压力为 280 bar，然后在自制的 150 μm × 30 cm 硅胶微柱上以 5–35% 的梯度进行分离流动相 B（乙腈和 0.1% 甲酸），流速为 600 nl/min，持续 150 分钟。 QE HF 的 MS 分析是在 3e6 离子的自动增益控制目标下进行一次全扫描，然后进行多达 30 次与数据相关的 MS/MS 扫描具有更高能量的碰撞解离，在 Orbitrap 中检测到（R = 15,000 在 200 m/z）。

研究结果：

基于RNA-seq数据的共表达网络的功能富集分析和枢纽分子鉴定。

基于蛋白质数据的共表达网络的功能富集分析和枢纽分子鉴定。

RNA-seq 和蛋白质组学揭示了对三种药物的反应之间的强相关性，具有几乎相同的效果。GO 富集显示差异表达的基因包括参与代谢调节、转录和翻译的基因。

司来帕格、马西替坦和复氧可改善 HAPH。Serpina1、Cryz 和 Cmc1 被鉴定出来，通过多组学筛选，作为参与HAPH的关键基因。这些发现为 HAPH 的靶向药物机制提供了新的见解。

研究结论：

Selexipag、macitentan 和复氧显着减弱了大鼠 HAPH 模型，而 riociguat 的作用较弱。 差异表达的基因参与代谢调控、转录和翻译。 某些蛋白质受到 HAPH 和治疗的影响。 我们使用多组学方法筛选了关键基因 Serpina1、Cryz 和 Cmc1。 这些发现可能有助于更好地了解缺氧所涉及的分子机制，并可能提供新的治疗靶点。

文献出处：

Xu X, Li H, Wei Q, Li X, Shen Y, Guo G, Chen Y, He K, Liu C. Novel Targets in a High-Altitude Pulmonary Hypertension Rat Model Based on RNA-seq and Proteomics. Front Med (Lausanne). 2021 Nov 3;8:742436. doi: 10.3389/fmed.2021.742436. PMID: 34805208; PMCID: PMC8595261.