传统与现代、体内与体外多角度结合：党参抑制肝癌分子机制

2024-03-29 网络网络发表于上海

传统中药具有多靶点和广泛的治疗作用，已成为治疗各种肿瘤的潜在方法。党参作为一种草药，因其多方面的药理特性（包括抗炎和抗氧化作用）而备受关注。

肝癌是一种高发病率和高死亡率的恶性肿瘤，给全球带来沉重的疾病负担。每年都有数百万新的肝癌病例被确诊，这凸显了对改进治疗策略的迫切需求。尽管在外科干预、化疗和放疗方面取得了重大进展，但肝癌患者的预后仍然令人沮丧，特别是在晚期阶段，治疗选择严重有限，导致五年生存率显著偏低。此外，当前的治疗方法往往具有副作用，给患者带来额外的身体和经济负担。因此，寻找安全有效的肝癌治疗方法仍然是肿瘤学领域面临的重大挑战。

传统中药具有多靶点和广泛的治疗作用，已成为治疗各种肿瘤的潜在方法。党参作为一种草药，因其多方面的药理特性（包括抗炎和抗氧化作用）而备受关注。近年来，关于党参对不同类型癌症的抑制作用的研究越来越多。然而，党参治疗肝癌的确切分子机制仍未完全阐明。据研究提示，CDK1 和 PDK1/β-Catenin 等关键蛋白和信号通路已被确定为影响肝癌生长和转移的关键因素。然而，了解如何调节这些关键因素以阻碍肝癌的进展还需要进一步的研究。

近期，研究者在《Phytomedicine》杂志发表了一篇文章，标题为“Molecular mechanisms of Codonopsis pilosulain inhibiting hepatocellular carcinoma growth and metastasis”，文中通过综合多种研究方法，如网络药理学分析、转录组测序和生物信息学分析，以及体外内实验的验证，充分探讨和揭示了党参调节 CDK1 介导的 PDK1/β-Catenin 信号通路、抑制肝癌细胞的 EMT 过程和降低细胞干性的复杂分子机制。

图1 论文首页

党参多糖对肝癌有治疗潜力的35个靶基因的识别

为了研究党参治疗肝癌的潜在机制，研究者利用网络药理学和转录组测序分析了潜在的药物靶点和作用机制（图 2A）。首先，在GeneCards数据库中搜索肝癌条目，结果显示有19,681个差异表达基因。此外，利用不同浓度的党参多糖溶液（CPP）处理了四种人类肝癌细胞系，即 Huh-7、Hep3B、Huh-1 和 PLC/REF/5。随后，在培养 48 小时后使用 CCK-8 试验评估了细胞活力。结果表明，Huh-7 对 CPP 具有高度敏感性。CPP 对 Huh-7 的抑制作用非常显著，当 CPP 浓度达到 200 μg/ml 时，Huh-7 的活性降低了 50%（图 2B）。因此，研究者选择先用 200 μg/ml CPP 处理 Huh-7 细胞，然后再进行转录组测序分析。随后，研究者对未处理组和 CPP 处理组进行了差异分析，确定了 434 个差异表达基因（图 2C）（另见文章附表 S2）。

接着，研究者从Herb数据库中提取了党参的活性化学成分，并对这些成分进行了筛选，结果确定了 16 种有效成分（另见文章附表 S3）。将有效成分的 SMILES 代码导入 SWISSTARGET预测数据库，得到有效成分的靶点预测结果。剔除重复数据后，共得到 638 个靶点。将这些药物靶点与肝癌中差异表达基因相交，最终得到了 35 个候选基因（图 2D）（另见文章附表 S4）。通过上述分析，研究者确定了使用党参治疗肝癌的35 个靶基因。

图2 从党参中筛选保护肝细胞癌的候选基因和化学成分

阐明CPP治疗肝癌的机制：CDK1 信号通路的作用

为进一步研究CPP治疗肝癌的机制，研究者利用生物信息学技术对上述结果（图3A）进行了补充分析。研究者对 35 个候选基因进行了GO功能分析和KEGG通路分析。基因根据调整后的p值阈值小于0.01进行了排名。结果表明，在 GO 功能分析排名前 100 位的基因中，与细胞凋亡调控、脂质代谢、细胞周期 G2/M 过渡和细胞分裂等生物过程（BP）相关的条目参与其中。在细胞成分（CC）方面，研究者发现了与纺锤体等相关的条目。在分子功能（MF）方面，条目包括核苷酸结合等方面。KEGG 分析结果表明，这 35 个差异表达基因参与了氧化还原酶活性、与供体 CH-OH 基团的相互作用以及细胞对氧化应激的反应等非活性过程（图3B-E）。

这35个候选基因编码的蛋白质被导入STRING数据库。然后，基于它们的Degree值构建了一个节点图（图3F），以确定蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）关系。利用Cytoscape软件构建了PPI网络（图3G）。因此，研究者推测，CPP可能通过调节CDK1信号通路来治疗肝癌。

图3 肝细胞癌关键机制的生物信息学分析

CPP抑制CDK1 / PDK1 /β - catenin信号通路：肝癌治疗中的关键机制

研究者利用TCGA数据库中肝癌患者的临床RNA测序数据，搜索并分析了CDK1的表达差异和生存曲线。结果显示，与邻近的非癌组织相比，CDK1在肝癌组织中的表达呈上调趋势（P <0.01）。此外，CDK1的表达与肝癌患者的生存时间存在相关性（图4A-B）。通过生物信息学分析，研究者发现 CDK1 是党参保肝作用的靶点。富集分析结果表明，CDK1通过调节细胞凋亡和细胞周期的G2/M期发挥其作用。CDK1 在细胞周期中与其下游因子 PDK1 相互作用，共同调控细胞周期。据报道，降低 CDK1 的活性可抑制 PDK1 的磷酸化，从而抑制β-catenin 的激活，这可能影响EMT过程，并降低肿瘤细胞的干性。因此，研究者推测党参的保护作用可能与抑制CDK1/PDK1/β-Catenin信号通路、调节EMT过程、抑制肿瘤细胞干性有关。

为了研究CPP在CDK1/PDK1/β-Catenin信号通路中的调控作用，实验组分为PBS组、CPP干预组、CPP+Lv-NC组和CPP+Lv-CDK1组。用 200 μg/ml CPP 处理 Huh-7 和 PLC/PRF/5 细胞。在 CPP+Lv-NC 组和 CPP+Lv-CDK1 组中，除了 200μg/ml CPP 处理外，还进行了 Lv-NC 和 Lv-CDK1 慢病毒干预。通过Western blot和RT-qPCR检测了各组Huh-7和PLC/PRF/5细胞中CDK1、PDK1和β-Catenin的蛋白和mRNA表达水平。

结果表明，与对照组相比，CPP 组和 CPP-Lv-NC 组 Huh-7 和 PLC/PRF/5 细胞中 CDK1、PDK1 和 β-Catenin 的表达水平明显下调（p < 0.01）。在 Lv-CDK1 的干预下，这种下调被逆转。与 CPP+Lv-NC 组相比，差异具有统计学意义（p < 0.01）（图 4C-E；另见文章附图S2A-B）。

综上所述，CPP可抑制CDK1/PDK1/β-Catenin信号通路因子在体外的表达，这可能是其治疗肝癌的关键机制。

图4 CPP干预对Huh-7细胞中CDK1/PDK1/β-Catenin通路信号因子的影响

CDK1 过表达可逆转CPP在肝癌细胞中的抗增殖和促凋亡作用

为了确定 CPP 对肝癌细胞生长的抑制作用，研究者首先采用 CCK-8 试验和集落形成实验来评估 Huh-7 和 PLC/PRF/5 细胞的生长情况。CCK-8试验分别在0、12、24、36和48小时进行，以测定各组细胞的存活率。结果表明，在 CPP 干预后 12、36 和 48 小时，Huh-7 和 PLC/PRF/5 细胞的活性受到明显抑制（p < 0.05）。然而，这种抑制作用在 Lv-CDK1 干预后被逆转（p < 0.05）（图 5A；另见文章附图 S3A）。集落形成实验结果显示，与对照组相比，CPP干预组和CPP+Lv-NC组的Huh-7和PLC/PRF/5细胞簇数量显著减少（p < 0.01）。然而，这种干预效果在 CPP+Lv-CDK1 组中被逆转（图 5B；另见文章附图 S3B）。

此外，研究者采用流式细胞术评估了各组 Huh-7 和 PLC/PRF/5 细胞的细胞周期分布。结果表明，与对照组相比，在 CPP 的干预下，处于 S 期的 Huh-7 和 PLC/PRF/5 细胞数量显著减少，而处于 G2/M 期的细胞数量显著增加（p < 0.01）。在 CDK1 过表达干预下，这一变化被逆转，与 CPP+Lv-NC 组相比，差异有统计学意义（p < 0.01）（图 5C-D；另见文章附图 S3C-D）。

随后，为了研究CPP对Huh-7和PLC/PRF/5细胞凋亡的影响，研究者采用TUNEL染色检测DNA片段和细胞死亡。如图 4E 所示，在 Huh-7 和 PLC/PRF/5 细胞中，CPP 组和 CPP+Lv-NC 组的 TUNEL 阳性染色细胞数量均显著增加（p < 0.01），而 LvCDK1 则抑制了 CPP 的促凋亡作用。Western blot分析进一步检测了Huh-7和PLC/PRF/5细胞中关键凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达。结果显示，在CPP的影响下，与对照组相比，CPP组和CPP+Lv-NC组Bax的表达量都明显增加，而Bcl-2的表达量则明显减少（p < 0.01）。在CPP-Lv-CDK1组，这种表达调节被逆转（图5E；另见文章附图S3E）。

总之，上述结果表明，CPP能抑制肝癌细胞的增殖、调节细胞周期并诱导细胞凋亡。然而，过表达 CDK1 会逆转这种作用。

图5 CPP 对Huh-7 细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响

CDK1 过表达可逆转CPP对肝癌细胞迁移、侵袭和干性的抑制作用

为了研究 CPP 对肝癌细胞迁移和侵袭的影响，研究者进行了细胞划痕和侵袭试验。结果显示，与对照组相比，CPP组显著抑制了Huh-7和PLC/PRF/5细胞的迁移和侵袭（p < 0.01）。同样，与对照组相比，CPP+Lv-NC 组也观察到了类似的结果，而 Lv-CDK1 组则逆转了 CPP 的抑制作用（p < 0.01）（图 6A-B；另见文章附图 S4A-B）。

研究者假设 CPP 可通过抑制 EMT 和降低细胞干性来抑制肝癌。为了验证这一假设，研究者首先使用Westernblot分析法评估了Huh-7和PLC/PRF/5细胞中EMT相关蛋白的表达。结果显示，CPP干预后，Huh-7和PLC/PRF/5细胞中上皮标志物E-cadherin和α-catenin的表达上调，而间充质标志物N-cadherin、vimentin、Slug和MMP9的表达下调（p < 0.01）。Lv-NC不影响这些表达变化，但 Lv-CDK1 逆转了这些变化（图 6C；另见文章附图 S4C）。

接下来，研究者进行了细胞成球实验。结果观察到，与对照组相比，CPP组的Huh-7和PLC/PRF/5细胞的球形体积显著减少，球形形成率明显下降（p < 0.01）。然而，Lv-CDK1 逆转了这种抑制作用（p < 0.01）（图 6D；另见文章附图 S4D）。

此外，研究者还进行了Western blot分析，检测了各组Huh-7和PLC/PRF/5细胞中干细胞蛋白Oct4、Sox2和Nanog的表达。结果表明，与对照组相比，经CPP处理的Huh-7和PLC/PRF/5细胞中Oct4、Sox2和Nanog的表达明显下调（p < 0.01）。此调控作用也被Lv-CDK1抑制（图 6E；另见文章附图 S4E）。

上述结果证明，CPP可抑制细胞迁移和侵袭，同时通过抑制EMT过程降低肝癌细胞的干性。然而，CDK1的过表达抵消了CPP的抑制作用。

图6 CPP 对 Huh-7 细胞侵袭、上皮间充质转化过程和细胞干性的影响

CPP对小鼠肝癌模型中CDK1、PDK1和β-catenin的剂量依赖性抑制被CDK1过表达逆转

为了进一步验证假设，研究者创建了裸鼠皮下肿瘤模型，并通过随机分配将其分为不同的组别。LC 组为肝癌模型组，低 CPP 组、中 CPP 组和高 CPP 组每天分别灌胃低剂量（25 mg/kg/day）、中剂量（50 mg/kg/day）和高剂量（100 mg/kg/day）的 CPP 进行治疗。此外，高CPP+Lv-NC组和高CPP+Lv-CDK1组在进行Lv-NC和Lv-CDK1慢病毒转导慢病毒转染后，接受高剂量CPP灌胃治疗。每组小鼠 6 只（图 7A）。

采用Western Blot和RT-qPCR技术测定了不同组小鼠皮下异种移植中CDK1、PDK1和β-Catenin蛋白和mRNA的表达水平。结果表明，与LC模型组相比，不同剂量的胃内CPP治疗可降低肝癌小鼠肝组织中CDK1、PDK1和β-Catenin的蛋白和mRNA表达水平（p < 0.05）。此外，还观察到了剂量依赖关系。然而，由于 Lv-CDK1 的影响，高剂量 CPP 灌胃对 CDK1、PDK1 和 β-Catenin 的抑制作用被抑制。这种抑制与高 CPP + Lv-NC 组之间的差异具有统计学意义（p < 0.01）（图 7B-C）。

总之，上述结果表明，CPP可以抑制肝癌小鼠CDK1、PDK1和β-Catenin信号因子的表达水平。

图7 CPP 对体内 CDK1/PDK1/β-Catenin 通路表达的影响

CPP抑制肝肿瘤生长和诱导细胞凋亡的体内验证：CDK1 过表达的逆转效应

在体外和体内证实了CPP对CDK1/PDK1/β-Catenin的抑制作用后，研究者研究了其在体内抑制肿瘤生长的作用。在这项研究中，研究者测量了小鼠的肿瘤体积和质量以获得结果。与模型组相比，不同剂量的 CPP 处理组对肿瘤体积和质量均有抑制作用（P < 0.01）。然而，当 Lv-CDK1 介入时，CPP 对肿瘤生长的抑制作用消失了（图 8A-C）。免疫组化染色用于检测细胞周期核蛋白 Ki67 和增殖细胞核抗原 PCNA 的表达。结果表明，LC 组小鼠肝脏肿瘤组织中 Ki67 和 PCNA 均呈强阳性表达。然而，灌胃不同剂量的 CPP 会抑制这种阳性表达，并显示出一定程度的剂量依赖性（p < 0.05）。Lv-NC 对 CPP 的抑制作用没有影响（p > 0.05），而 Lv-CDK1 则逆转了这种抑制作用（p <0.01）（图 8D）。

此外，Western blot分析评估了小鼠皮下异种移植中与上皮-间质转化（EMT）相关因子的蛋白表达情况。结果表明，在不同剂量的CPP灌胃治疗中，E-cadherin和α-catenin的表达上调，而N-cadherin、Vimentin、Slug和MMP9的表达下调（p < 0.01）。这种基因表达调控表现出剂量依赖关系。Lv-NC 的干预并不影响高剂量 CPP 灌胃治疗对上述因子表达的调控作用（p > 0.05），但 Lv-CDK1 逆转了这种调控作用（p < 0.01）（图 8E）。

为了验证 CPP 在体内调控肿瘤细胞凋亡的作用，研究者对小鼠皮下肿瘤组织进行了 TUNEL 染色。结果表明，随着灌胃不同剂量的CPP，TUNEL染色阳性细胞的数量增加（p < 0.01），表明其作用具有剂量依赖性。Lv-NC 的干预并不影响阳性细胞的数量（p > 0.05）。然而，干预 Lv-CDK1 后，荧光标记的阳性细胞数量显著减少，与高 CPP+Lv-NC 组相比有统计学差异（p < 0.01）（图 8F）。

因此，以上实验结果证明，CPP 对肝癌小鼠的肿瘤生长具有抑制作用，并且可以诱导肿瘤细胞凋亡。此外，还观察到通过过表达 CDK1 的干预可以逆转此种效应。

图8 CPP 对肝癌小鼠肿瘤生长和迁移的抑制作用

结论

综上分析，党参可能通过抑制 CDK1 和影响 PDK1/β-catenin 信号轴、限制细胞 EMT 和降低细胞干性来抑制肝细胞癌的生长，这些发现为党参在肝癌中的潜在治疗作用提供了有力的科学证据。同时，该研究将中医药与现代医学方法相结合，为全面管理肝癌提供了一个有前景的途径，使这项研究具有深远的理论和实践意义。

图9 CPP 通过抑制CDK1 影响 PDK1/β-Catenin 信号转导治疗肝癌的机制

参考文献：

Li N, Yang C, Xia J, Wang W, Xiong W. Molecular mechanisms of Codonopsis pilosula in inhibiting hepatocellular carcinoma growth and metastasis. Phytomedicine. 2024 Jan 7;128:155338. doi: 10.1016/j.phymed.2024.155338. Epub ahead of print. PMID: 38520835.

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2024-04-10 梅斯管理员来自上海

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