中国医学科学院肿瘤医院刘芝华教授《自然·通讯》：cfDNA甲基化多模态超早期识别食管鳞癌和癌前病变

食管癌是最常见的消化道肿瘤之一，全球约55%的食管癌发生在中国，其中主要为食管鳞癌（ESCC，占新发食管癌的88%）。ESCC也是预后最差的肿瘤之一，5年总生存率仅为36.9%，主要归因于发现较晚。早期ESCC，如粘膜内ESCC和癌前病变（如上皮内瘤变），可以通过内镜下切除而免于复杂的开放手术，患者的5年无病生存率能达到98%-100%。因此，早期发现对于提高ESCC患者的生存率和生活质量至关重要。当前食管癌的早诊主要依赖于胃镜检查和活检，但根据国家癌症中心/中国医学科学院肿瘤医院食管癌早诊早治工作测算，基于当前的内镜设备和专业人员，我国每年尚有近亿人的内镜筛查缺口，亟需开发更为客观、准确、便捷的新型食管鳞癌早诊方法。

针对这一临床难题，中国医学科学院肿瘤医院分子肿瘤学全国重点实验室刘芝华教授此前鉴定了ESCC的miRNAs（Mol Cancer. 2022）[1]和lncRNAs（Nat Commun. 2023）[2]等液体活检标志物，为食管癌早期诊断提供了新线索。近期，与温州医科大学生物医学大数据研究所苏建忠教授合作开发了血浆游离DNA（cell-free DNA, cfDNA）全基因组甲基化多模态分析框架，系统解析了ESCC和癌前病变患者cfDNA甲基化和遗传学特征的全景信息、出现时序和互补性，进一步提高了早诊准确性，把ESCC的早诊窗口前移至癌前病变。并证实了cfDNA甲基化特征与本研究团队先前提出的ESCC分子分型（Cancer Cell. 2023）[3]高度相关，成果以“Multimodal analysis of cfDNA methylomes for early detecting esophageal squamous cell carcinoma and precancerous lesions”为题发表在Nature communications [4]。

此前基于cfDNA甲基化的肿瘤早筛方法在众多肿瘤中虽显示出一定准确性，但尚存一些问题：首先，cfDNA全基因组亚硫酸氢盐甲基化测序（whole-genome bisulfite sequencing，WGBS）数据中的拷贝数变异（copy number variants，CNVs）和片段特征的诊断意义尚未被挖掘；其次，ESCC中遗传和表观遗传改变的先后顺序和互补性仍不清楚；再者，用于早诊的cfDNA甲基化特征的生物学意义和分型价值尚不明确。为了克服这些技术难题，研究团队对前期建立的155对ESCC 组织样本的全基因组多组学队列（the ESCC Genome and Epigenome Atlas，ECGEA）进行了重新分析。进一步收集了来自中国医学科学院肿瘤医院和上海胸科医院两个中心的 460 份 cfDNA样本，这些样本分别来自230 名早期/非转移性 ESCC 或食管癌前病变患者以及230名性别和年龄匹配的健康对照。对这些样本进行cfDNA WGBS测序，并对数据进行了深入分析。

研究团队开发了cfDNA WGBS 数据多模态分析（Expanded Multi-Modal Analysis，EMMA）框架，能够同步捕捉 cfDNA甲基化、CNV 和片段特征等多重信息。基于此框架，研究团队不仅识别出ESCC cfDNA中最具诊断价值的cfDNA甲基化、CNV和片段特征标志物，还深入剖析了这些特征间的时序性和互补性，提高了基于cfDNA早诊策略的准确率，将其诊断时间提前至癌前病变阶段，并揭示了其生物学意义和分型价值。

图1.多模态分析框架在cfDNA WGBS数据中同时识别 DNA 甲基化、CNV 和片段特征

首先，研究团队发现cfDNA甲基化特征可在50%的食管癌前病变和70%的早期ESCC样本中被检测到，是最早、最敏感的cfDNA标志物。相比之下，CNV 和片段特征具有高特异性（在健康个体中特异性为 98%以上），但在食管癌进程中出现较晚（图2）。

图2. cfDNA 甲基化特征出现最早、具有最高的诊断效能，而拷贝数变异和片段特征出现较晚，几种特征具有互补性，联合分析（EMMA）能够显著提高ESCC早诊准确率

接着，研究团队证实EMMA识别框架增强了cfDNA甲基化组的早诊潜力，可以在不增加检测成本的条件下提高诊断ESCC的诊断率（AUC从0.90提高到0.99），并能在保证特异性大于95%时诊断出87%的ESCC和62%的食管癌前病变。与单纯依赖cfDNA甲基化特征相比，EMMA对于各分期的ESCC均表现出更高的检出率，并能进一步提高ESCC患者的生存获益（图3）

图3. cfDNA多模态联合分析（EMMA）能够显著提高各分期的ESCC和癌前病变的检出率，并具有提高ESCC 5年生存率的巨大潜力

更值得注意的是，用于ESCC诊断的cfDNA 甲基化特征与研究团队前期发现ESCC分子亚型（Liu et al., Cancer Cell. 2023）[3]和肿瘤微环境构成显著相关。根据cfDNA 甲基化特征对ESCC肿瘤组织的DNA甲基化进行聚类，可以分为高、中和低DNA甲基化组三组。其中，高DNA甲基化组展现了更高的细胞周期激活型（cell cycle pathway activation，CCA）ESCC 占比，并具有更高比例的上皮细胞成分。低DNA甲基化组与免疫调节型（immune modulation，IM）ESCC相关，并呈现出更高的免疫细胞成分。相比此前cfDNA甲基化标志物，该研究创新性的提供了一种实时监测分子特征并指导治疗策略的液体活检方式（图4）。

图4. cfDNA 甲基化特征与分子亚型和肿瘤微环境成分相关

总的来说，该研究结果不仅证实了基于cfDNA全基因组甲基化组的多模态分析有助于ESCC的早期诊断和分子特征监测，还将其应用于癌前病变识别，有助于进一步提高患者的生存获益。此外，该成果不仅为ESCC早诊提供了新的无创诊断方法，还揭示了cfDNA甲基化具有无创分型和指导治疗的伴随诊断价值，进一步拓展了cfDNA甲基化的分析策略和应用场景。

中国医学科学院肿瘤医院副院长刘芝华教授、温州医科大学生物医学大数据研究所所长苏建忠教授、中国医学科学院肿瘤医院陈洪岩教授为该论文的共同通讯作者，中国医学科学院肿瘤医院刘嘉琦副主任医师、王强副主任医师和温州医科大学在读博士生代丽君、李成浩为本论文的共同第一作者。本研究得到国家重点研发计划和国家自然科学基金等项目资助。

参考文献：

1.Miyoshi J, Zhu Z, Luo A, Toden S, Zhou X, Izumi D, Kanda M, Takayama T, Parker IM, Wang M, Gao F, Zaidi AH, Baba H, Kodera Y, Cui Y, Wang X, Liu Z, Goel A. A microRNA-based liquid biopsy signature for the early detection of esophageal squamous cell carcinoma: a retrospective, prospective and multicenter study. Mol Cancer. 2022 Feb 11;21(1):44. doi: 10.1186/s12943-022-01507-x.

2.Zhou M, Bao S, Gong T, Wang Q, Sun J, Li J, Lu M, Sun W, Su J, Chen H, Liu Z. The transcriptional landscape and diagnostic potential of long non-coding RNAs in esophageal squamous cell carcinoma. Nat Commun. 2023 Jun 26;14(1):3799. doi: 10.1038/s41467-023-39530-1.

3.Liu Z, Zhao Y, Kong P, Liu Y, Huang J, Xu E, Wei W, Li G, Cheng X, Xue L, Li Y, Chen H, Wei S, Sun R, Cui H, Meng Y, Liu M, Li Y, Feng R, Yu X, Zhu R, Wu Y, Li L, Yang B, Ma Y, Wang J, Zhu W, Deng D, Xi Y, Wang F, Li H, Guo S, Zhuang X, Wang X, Jiao Y, Cui Y, Zhan Q. Integrated multi-omics profiling yields a clinically relevant molecular classification for esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Cell. 2023 Jan 9;41(1):181-195.e9. doi: 10.1016/j.ccell.2022.12.004.

4.Liu J, Dai L, Wang Q, Li C, Liu Z, Gong T, Xu H, Jia Z, Sun W, Wang X, Lu M, Shang T, Zhao N, Cai J, Li Z, Chen H, Su J, Liu Z. Multimodal analysis of cfDNA methylomes for early detecting esophageal squamous cell carcinoma and precancerous lesions. Nat Commun. 2024 May 2;15(1):3700. doi: 10.1038/s41467-024-47886-1.

5.Cui Y, Chen H, Xi R, Cui H, Zhao Y, Xu E, Yan T, Lu X, Huang F, Kong P, Li Y, Zhu X, Wang J, Zhu W, Wang J, Ma Y, Zhou Y, Guo S, Zhang L, Liu Y, Wang B, Xi Y, Sun R, Yu X, Zhai Y, Wang F, Yang J, Yang B, Cheng C, Liu J, Song B, Li H, Wang Y, Zhang Y, Cheng X, Zhan Q, Li Y, Liu Z. Whole-genome sequencing of 508 patients identifies key molecular features associated with poor prognosis in esophageal squamous cell carcinoma. Cell Res. 2020 Oct;30(10):902-913. doi: 10.1038/s41422-020-0333-6.