宽胸气雾剂防治心肌损伤机制揭示，MAPK等分子参与其中

宽胸气雾剂在临床上常用于缓解心绞痛，效果良好，但是分子机制尚未阐明。最近发表在Journal of Ethnopharmacology上的研究论文，全面揭示宽胸气雾剂保护心肌损伤的分子机制。

1. 背景

缺血性心脏病是临床常见的心血管疾病，具有较高的发病率和死亡率。缺血性心脏病主要由冠状动脉循环变化导致心肌缺血和缺氧。当冠状动脉血液或氧气供应不足以满足心肌代谢的需求时，将导致不可逆的心肌损伤。在此过程中，细胞凋亡是心肌损伤(MI)的重要环节之一。因此，有效预防细胞凋亡对MI的防治具有重要意义。

宽胸气雾剂(KXA)是以方香温通(FXWT)疗法为基础，治疗心绞痛的临床常用药。但KXA防治心肌损伤(MI)的药理机制尚不明确。

2. 方法

研究包括雄性Wistar Kyoto大鼠。将大鼠随机分为以下5组（每组n=6）：对照组、ISO组、单硝酸异山梨酯(ISMN)组(5mg/kg)、KXA-L组(0.1mL/kg)、KXA-H组(0.3mL/kg)。后3组大鼠灌胃给药14d，对照组和ISO组大鼠每日给予等量生理盐水。在第13天和第14天使用ISO(120mg/kg)诱导MI。评估了心电图(ECGs)、心肌特异性酶、组织病理学变化和细胞凋亡情况。

3. 结果

3.1 KXA的化学成分

GC-MS分析表明，KXA中含有已鉴定的58种化合物，占总的75.32%。其中α-檀香醇含量最高，占总成分的27.01%。鉴定出的其他主要化合物包括冰片(6.62%)、环己烯、1-甲基-3-（1-甲基乙烯基）(6%)、桉叶油(5.68%)和α-佛手醇(4.88%)（图1和表1）。

图1.宽胸气雾剂(KXA)中排名前四位的主要化合物

表1 KXA的化学组成

3.2 KXA对ISO诱导的MI具有保护作用

与对照组比较，ISO组的ST段明显升高(P=0.020)，30min内ECGs未恢复，表明MI建模成功。

与ISO组相比，ISMN组和KXA组（0.1mL/kg和0.3mL/kg）的ST段显著降低，且KXA组的效果优于ISMN组（图2A和2B）。与对照组相比，血清CK-MB（图2C）和cTn-T(图2D)水平在ISO组显著升高，经ISMN和KXA（0.1mL/kg和0.3mL/kg）处理后CK-MB、cTn-T水平显著降低。以上结果表明，KXA能显著改善ISO诱导的MI。

图2：宽胸气雾剂(KXA)对异丙肾上腺素(ISO)诱导的心肌损伤(MI)大鼠ST段和心肌特异性酶的影响。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001 与对照组相比；#P<0.05、##P<0.01、##P<0.001与ISO组相比。

3.3 KXA可明显改善ISO引起的心肌组织病理改变

如图3所示，对照组心脏整体结构无明显异常（图3A)。而ISO组出现一些病理改变，如心肌纤维增厚肿胀、排列紊乱、断裂、间隙疏松、空泡及间质水肿、明显的心肌血管损伤（图3B)。ISMN后（图3C）和KXA（0.1mL/kg和0.3mL/kg；图3D和3E）处理后，心肌细胞基本正常，上述病理现象明显改善。

图3.宽胸气雾剂(KXA)对ISO诱导的大鼠心肌损伤(MI)心肌组织病理学的影响（HE染色，放大倍数×400）：(A)心肌的肌原纤维结构正常。(B)心肌纤维增粗肿胀排列紊乱（箭头），肌纤维断裂（箭头），心肌纤维间隙松散（箭头），存在空泡和间质水肿（箭头），存在心肌血管损伤。(C-E)心肌细胞接近正常，心肌损伤明显改善。

3.4 KXA通过抑制心肌细胞凋亡改善ISO诱导的MI

如图4A TUNEL法显示ISO诱导显著增加心肌细胞凋亡。ISMN和KXA（0.1mL/kg和0.3mL/kg）处理后心肌细胞凋亡明显下降。利用western blot分析进一步探索KXA对凋亡相关蛋白表达的影响（图4B)，结果显示，ISO下调Bcl-2的表达（图4C），并上调Bax（图4D）和caspase-3（图4F）的表达，因而显著下调Bcl-2/Bax的比值（图4E），导致心肌细胞死亡。 KXA（0.1mL/kg和0.3mL/kg）处理显著上调Bcl-2（P=0.013或P=0.032）的表达，下调Bax（P=0.029或P=0.01）和caspase-3（P=0.022或P=0.002）的表达，因而增加Bcl-2/Bax的比值（P=0.001或P=0.031）。以上结果提示KXA对MI的改善可能通过抑制心肌细胞凋亡而发挥作用。

图4.宽胸气雾剂(KXA)对异丙肾上腺素(ISO)诱导的心肌细胞凋亡的影响。(A)对TUNEL法检测心肌细胞凋亡的代表性图像和TUNEL阳性细胞（箭头）进行统计学分析(n=6)。(B)western blot分析检测凋亡相关蛋白的表达水平。3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为对照。根据western blot结果进行(C)Bcl-2、(D)Bax、(E)Bcl-2与Bax的比值、(F)caspase-3的定量分析(n=3)。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001，与对照组相比；#P<0.05、##P<0.01、##P<0.001，与ISO组相比。

3.5全基因组基因表达谱分析

转录组测序比较各组心肌组织DEGs、聚类图（图5A）和火山图（图5B），以便更好地显示DEGs的分布。结果显示，与对照组相比，ISO组共有1682个DEGs显著表达，其中968个基因显著上调，714个基因显著下调。与ISO组相比，KXA组有649个DEGs显著表达，其中258个基因显著上调，391个基因显著下调。此外，ISO组中90个重叠基因上调，KXA处理后下调，而ISO组中27个重叠基因下调，KXA处理后上调（图5C和5D）。ISO组上调、KXA组下调的前5位基因详情见表2，ISO组下调、KXA组上调的前5位基因详情见表3。

图5.KXA治疗对ISO诱导MI大鼠DEG的影响。(A)显示DEGs的分层聚类图。(B)显示DEGs的火山图（|倍数变化|≥1.2，P<0.05）。红色代表上调的差异基因，蓝色代表下调的差异基因，黑色代表无显著差异的基因。（图C和D）根据差异基因表达谱绘制Venn图。红圈表示ISO组上调或下调基因数，绿圈表示KXA组上调或下调基因数。

表2.ISO组上调、KXA组下调的前5位基因

表3.ISO组下调、KXA组上调的前5位基因

3.6 通路富集分析

GO分析主要从生物学过程、细胞组成、分子功能等方面分析生物靶标。最富集的GO如图6A和6B，我们对ISO组与对照组和KXA组与ISO组进行了交集分析，获得了5604个共同的生物学过程（图6C），668个常见细胞成分（图6D）和1028个共同分子功能（图6E)。结果表明，富集的基因主要表现在细胞生物学过程、外界刺激、细胞增殖、细胞死亡、免疫系统反应、炎症反应等方面的调控。同时，我们还进行了KEGG通路富集分析，进一步探讨了KXA治疗MI的病理机制，并鉴定了ISO组与对照组和KXA组与ISO组功能相关的基因通路。前30位显著富集的信号通路如图7A和7B所示。其中，ISO组与对照组和KXA组与ISO组有260条重叠通路（图7C）。其中MARK信号通路是最富集的。

图6.DEGs的GO分析。将前30个富集条目作为条形图，分析(A)异丙肾上腺素(ISO)与对照组(B)宽胸气雾剂(KXA)与ISO的相关生物学功能。较高的横坐标值与较多的DEG富集相关。从(C)生物学过程、(D)细胞组分和(E)分子功能三个方面分析ISO与对照和KXA与ISO之间的重叠生物靶标，并绘制Venn图。

图7.KEGG富集分析，选择前30个富集项以确定与(A)异丙肾上腺素(ISO)与对照组和(B)宽胸气雾剂(KXA)与ISO相关的功能信号通路。横坐标代表富集途径的P调整值。(C)通过Venn图显示ISO组与对照组和KXA组与ISO组之间的重叠通路。

3.7 KXA抑制ISO诱导的MI大鼠MAPK信号通路活化

经western blot分析检测MAPK信号通路中的蛋白表达，我们发现ISO显著上调p38(p=0.005)和JNK(p=0.015)的磷酸化，下调ERK1/2的磷酸化(p=0.019)。ISMN和KXA（0.1mL/kg和0.3mL/kg）预处理可显著降低p-p38（图8A和8D；ISMN：P=0.005；KXA-L：P=0.007；KXA-H：P=0.016）和P-JNK的表达（图8B和8E；ISMN：P=0.012；KXA-L：P=0.020；KXA-H：P=0.001），而KXA(0.1mL/kg)预处理显著上调P-ERK1/2的表达（图8C和8F；P=0.008）。

图8：宽胸气雾剂(KXA)对异丙肾上腺素(ISO)诱导的p38、JNK和ERK磷酸化的影响(A-C)p-p38、p-JNK和p-ERK的免疫印迹。(D-F)p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-ERK/ERK的定量统计分析。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001与对照组相比；#P<0.05、##P<0.01、##P<0.001与ISO组相比。

4. 结论

KXA能通过MAPK途径抑制心肌细胞凋亡，保护心肌细胞免受ISO损伤，改善MI。

参考文献：

1. Lu Y , et al. Kuanxiong aerosol inhibits apoptosis and attenuates isoproterenol-induced myocardial injury through the mitogen-activated protein kinase pathway[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2020:113757.