IVD新技术：泪液生物标志物进行AD的早期诊断和监测

阿尔茨海默病(AD)是最常见的神经退行性疾病，早期诊断对于及时用药和改善预后至关重要，因为在病程早期开始治疗可以最大限度地保留患者的残余功能，减缓痴呆症状的发生和进展。AD的诊断是基于对临床体征和症状的观察，神经认知功能的测试，以及对AD生物标志物变化的检查。生物传感器的发展能够以非侵入性方式敏感和选择性地检测AD生物标志物，同时快速跟踪生物标志物浓度随时间的变化，可以提高从症状前和前驱阶段到痴呆症诊断的临床信心。

免疫测定允许定量分析和检测特定分子(例如，蛋白质，致病性抗原，抗体和小分子)具有高精度和灵敏度，是应用最广泛的诊断技术之一。尽管人们努力开发适用于临床样本的高性能诊断方法，但使用脑脊液和血液等侵入性标本诊断AD仍然存在局限性。因此，迫切需要开发一种易于获取和敏感的传感系统，能够使用与疾病监测直接相关的非侵入性活检，以高精度和高成本效益地区分AD的进展阶段。

近日，一组来自韩国的研究团队在杂志Nature Communications上发表了一篇题为“Amplified fluorogenic immunoassay for early diagnosis and monitoring of Alzheimer’s disease from tear fluid”的文章。作者提出了一种诊断工具，一种自组装纳米颗粒介导的扩增荧光免疫分析法(SNAFIA)，用于高度敏感地检测AD临床泪液样本中的生物标志物候选物CAP1蛋白。SNAFIA检测由抗体固定化磁性纳米颗粒(Ab-MNPs)和聚合物纳米探针(Ab-PNPs)组成，它们形成三明治结构的免疫复合物(Ab-MNP-CAP1-Ab-PNP)。该方法能够高度敏感和选择性地检测人泪液中的蛋白质生物标志物。SNAFIA对泪液中CAP1的检出限低(236 aM)，可靠性好(R2 = 0.991)，分析范围宽(0.320 ~ 1000 fM)。在39名受试者的验证阶段，SNAFIA在一小时内以90%的灵敏度和100%的特异性将AD患者与健康对照区分开来。因此，该SNAFIA系统可以为现有的商业免疫测定试剂盒和血液诊断测试提供一个很好的替代方案，用于诊断AD，并有可能应用于提供利用其他体液的疾病监测系统。

图片来源：Nature Communications

通过蛋白质组学分析发现人泪液生物标志物

为了研究新的可能用于AD诊断和进展监测的泪液生物标志物，作者使用发现队列的泪液样本进行了高分辨率和全面的蛋白质组学分析，发现队列由7名健康对照(HC)、7名轻度认知障碍(MCI)和7名AD参与者的泪液样本组成。通过深入的蛋白质组分析，与HC相比，作者在MCI和AD患者的眼泪中鉴定了75种差异表达蛋白(DEPs)，并最终选择了CAP1蛋白，与HC相比，其相对蛋白表达在MCI和AD患者的泪液中都发生了显著变化(分别为1.72和1.86倍)(图c)。

虽然CAP1的表达水平与其他蛋白相比没有表现出最明显的变化，但表现出从HC个体到MCI患者以及随后到AD患者的可识别且一致的增量表达趋势。在疾病进展过程中，这种明确的增加模式对于早期发现至关重要，而不仅仅是在特定疾病阶段的高表达。CAP1水平的逐步升高强调了其作为一种诊断标志物的潜在效用，特别是对于设计用于识别早期疾病的生物传感平台。

通过蛋白质组学分析发现人泪液AD生物标志物。

图片来源：Nature Communications

设计一个包含功能化纳米颗粒的SNAFIA平台

为了对目标蛋白进行高灵敏度检测，作者设计了一种利用两种功能化纳米粒子的免疫分析法:磁性纳米粒子(MNPs)和聚合物纳米探针(PNPs)(图a)。它们形成三明治结构的免疫复合物(Ab-MNP-CAP1-Ab-PNP)。Ab-MNP磁珠负责免疫复合物的分离和浓缩纯化，Ab-PNP负责信号放大。PNP中引入了Förster共振能量转移(FRET)染料对应用于SNAFIA实验(图e)。SNAFIA检测系统是基于由于DiO和DiI的荧光团解离而引起的FRET信号从高到低变化。

作者最终建立了SNAFIA测试的标准方案，其中DiO和DiI的负载染料10 μg，摩尔比为1:1，孵育时间为15 min。这确保了Ab-PNPs的快速和完全破坏，并产生最大的信号变化。并且测试结果表明，通过Ab-PNPs的FRET效应放大的信号可以应用于各种反应缓冲液和体液。

合成的Ab-MNP和Ab-PNP的表征。

图片来源：Nature Communications

利用生物流体中潜在的生物标志物评估SNAFIA

作者尝试使用CAP1蛋白评估SNAFIA的检测性能，CAP1蛋白被认为是AD的潜在生物标志物。首先用识别CAP1的IgG抗体包被Ab-MNPs和Ab-PNPs，以选择性捕获目标蛋白。将Ab-MNPs (0.1 mg/mL)和Ab-PNPs (0.1 mg/mL)加入不同浓度的含CAP1的PBS溶液中，孵育并洗涤后， 裂解Ab-PNPs，并记录FRET信号(图a)。SNAFIA从64.0fM到200pM的目标蛋白质中表现出线性信号，跨越5个数量级 (图b)。在人工泪液(ATF)中添加的CAP1蛋白进行了SNAFIA检测，结果显示可检测低至0.3 fM的CAP1蛋白。

利用人工泪液中的AD生物标志物评估SNAFIA。

图片来源：Nature Communications

SNAFIA与ELISA的检测性能比较

接下来作者比较了SNAFIA检测与经典免疫传感平台ELISA的检测性能。在ELISA测试中（图c），与SNAFIA相比，产生了更窄的动态范围。与ELISA相比，SNAFIA的检测范围提高了约102倍，LOD值降低了107倍。

作者研究了SNAFIA的检测方法的选择性和特异性。如图d所示，非靶蛋白载脂蛋白E (APOE)和乙酰胆碱酯酶(ACHE)在PBS缓冲液中对SNAFIA信号的产生没有显著影响，荧光信号选择性扩增为CAP1靶蛋白。除此之外，作者还验证了SNAFIA检测多种人类生物体液(包括泪液和血清)的通用性。SNAFIA信号在孵育30 min后出现明显信号，此后荧光强度逐渐增加。这些特性提高了灵敏度和选择性，简化了整个检测步骤，同时将检测时间缩短到不到1小时。

利用人工泪液中的AD生物标志物评估SNAFIA。

图片来源：Nature Communications

SNAFIA诊断应用的验证

最后，作者使用来自39个个体的不同验证队列的泪液验证了SNAFIA的临床适用性。该队列包括14名HC患者，15名MCI患者(称为临床前AD)和10名明确AD患者。作者建立了一个SNAFIA系统来检测泪液中的CAP1候选生物标志物，并分析了三组获得的荧光信号的差异(图b)。MCI组和AD组泪液样本中CAP1检测信号的平均强度分别约为HC组的1.77倍和2.57倍。MCI组和AD组的曲线下面积(AUC)分别为0.7619和0.9714 (图d)。因此，SNAFIA测试能够准确地从HC参与者中识别MCI和AD患者组，灵敏度为73.3%，特异性为100%，灵敏度为90%，特异性为100%。

SNAFIA在临床诊断中应用的验证。

图片来源：Nature Communications

SNAFIA的荧光强度与MMSE评分的关联

为了确保准确的个体诊断，作者使用临床泪液样本将SNAFIA的荧光强度与MMSE评分相关联。MMSE测试的认知测试得分越高，表明认知能力越好，AD风险越低。如图e所示，SNAFIA荧光强度与MMSE评分的Pearson相关系数(r)为-0.8255，说明SNAFIA可以有效区分AD的前驱和晚期。由于SNAFIA反映了个体当前的AD进展水平，SNAFIA简单、可靠、无创的诊断平台可以帮助预测MCI患者的AD进展，并通过定期的泪液重复检测来预防和管理痴呆。

SNAFIA的荧光强度与MMSE评分的关联。

图片来源：Nature Communications

总结与讨论

作者提出了一种利用表面功能化纳米材料(Ab-MNPs和Ab-PNPs)捕获、磁分离和选择性荧光信号放大的AD诊断系统。该方法能够高度敏感和选择性地检测人泪液中的蛋白质生物标志物。SNAFIA对泪液中CAP1的检出限低(236 aM)，可靠性好(R2 = 0.991)，分析范围宽(0.320 ~ 1000 fM)。在39名受试者的验证阶段，SNAFIA在一小时内以90%的灵敏度和100%的特异性将AD患者与健康对照区分开来。利用泪液作为液体活检，SNAFIA可能有助于长期护理计划，提高临床试验效率，并加速阿尔茨海默病的治疗发展。虽然这项研究是概念验证，但它强调需要更广泛的临床研究来全面验证这种方法的临床潜力。

SNAFIA是一种集成了磁分离系统和荧光纳米探针的免疫诊断平台，由于这种纳米颗粒设计的灵活性和可扩展性，它有可能从单个样品中产生针对不同生物标志物的多个可分离光信号。这种多路复用功能不仅简化了诊断过程，而且降低了测试成本和时间效率。96次测试中，MNPs和聚合物纳米探针每个130美元，而洗涤和裂解缓冲液每个5美元，总计270美元(每次测试2.8美元)，比ELISA等传统免疫测定法低三倍以上。随着平台的不断改进和大规模生产，预计进一步降低成本，使SNAFIA成为广泛临床使用的实用和经济的诊断工具。此外，可以将SNAFIA平台集成到人工晶状体技术中，可以通过其他信号读出(如电化学信号)实时监测AD。这种基于体外液体的无创测量技术有望改善现有阿尔茨海默病检测方法痛苦、有创、昂贵的问题，成为一种可以筛查患者和高危人群的系统，用于阿尔茨海默病的早期诊断和临床干预。