Science：MIT王潇团队开发空间翻译组学测序技术RIBOmap，以单细胞和分子分辨率揭示脑组织翻译调控机制

信使核糖核酸（mRNA）翻译的精确控制是细胞转录后基因调控的一个关键步骤，能够将mRNA分子转化为功能蛋白，以执行细胞的生理功能。此前的研究主要侧重于分析mRNA的表达水平，以此推断单细胞中对应蛋白质的含量，但蛋白质的生成同时受到转录和翻译两个过程调控，mRNA表达量和蛋白质含量之间的关联性并不强。现有的核糖体分析方法实现了全转录组的翻译分析，但缺乏空间信息；基于成像的方法保留了空间信息，但无法复用。因此，目前急需开发具备单细胞和空间分辨率的翻译组测序技术。

近日，美国麻省理工学院（MIT）王潇课题组在Science上发表了题为“Spatially resolved single-cell translatomics at molecular resolution”的文章。王潇团队开发了一种高度复用的空间翻译组测序技术RIBOmap，这是一种三维（3D）原位分析技术，可在分子分辨率上提供空间分辨的单细胞翻译组分析。RIBOmap采用了一种靶向测序策略，可通过特定的三探针设计，选择性地检测核糖体结合的mRNA。利用RIBOmap，该研究揭示了细胞周期依赖性翻译和亚细胞定位的mRNA翻译，以及细胞类型特异性和脑区特异性翻译调控。

文章发表于Science

据介绍，RIBOmap的构建是基于一种三元探针策略，包含与核糖体RNA杂交的splint DNA探针和一对与mRNA杂交的锁和引物探针。splint探针杂交结合到核糖体rRNA上，并作为splint环化临近的锁式探针；锁式探针靶向特定基因且含有基因特异条形码；引物探针可作为滚环复制的引物（图1）。三种探针可通过原位扩增产生具有基因独特条形码的DNA扩增子，实现对核糖体结合mRNA的选择性检测。通过该方法，mRNA被特异性地扩增并标记，能够在原位进行测序获得其相关的位置信息。

研究团队还使用非编码RNA、RNA翻译抑制剂Harringtonine和体外转录（IVT）mRNA设计了实验对RIBOmap进行验证。结果显示，RIBOmap特异性靶向核糖体结合的mRNA。

图1. RIBOmap设计和验证。来源：Science

研究团队将RIBOmap应用于HeLa细胞中，对981个基因进行了多路复用实验，并设计了一个多模态RIBOmap成像实验来捕捉细胞周期阶段和亚细胞细胞器（图2）。通过RIBOmap和STARmap分别对1,813个和1,757个细胞进行了测序，这两种方法均具有较高空间分辨率。结果显示，RIBOmap和STARmap数据集中鉴定的G1、G1/S和G2/M细胞周期阶段与预期的细胞周期依赖性FUCCI蛋白荧光信号一致，证明了RIBOmap在表征细胞状态方面的准确性。

通过差异基因分析，研究团队找到了在不同细胞周期通过翻译调控的基因。利用RIBOmap测序结果的高空间分辨率，确定了5个具有显著模块内相关性的协同调节翻译模块（RTM）。每个模块都富集了不同的功能途径，表明随着细胞的扩增和亚细胞细胞器的复制，蛋白质翻译机制在G1/S期上调，从而支持对蛋白质产物的需求。

通过RIBOmap，研究团队还确定了5个具有高度相关亚细胞空间组织和不同功能富集的共定位翻译模块（LTM1-5）。此外，分别有62.2%和94.6%的LTM4基因与邻近核糖体图谱数据集和APEX-RIP数据集重叠，证明了RIBOmap用于亚细胞空间分析的准确性。上述结果表明，RIBOmap可揭示HeLa细胞中存在细胞周期依赖性翻译调控和功能基因模块的共定位翻译。

图2. HeLa细胞中981个基因的RIBOmap分析。来源：Science

研究团队将RIBOmap应用于完整小鼠脑组织，同时检测了5,413个基因的翻译情况（图3）。利用RIBOmap测序结果，在小鼠脑组织中定义了11种主要细胞类型和38种亚细胞类型。基于上述细胞分型结果，研究团队绘制了小鼠大脑的单细胞空间图谱，其细胞的空间分布特征与先前研究结果一致，表明RIBOmap可准确识别不同的脑细胞类型。

图3. 小鼠大脑中54,13个基因的空间翻译组学分析。来源：Science

为将基于RIBOmap生成的结果与空间转录组学进行比较，以探究小鼠脑组织的翻译调控，研究团队分别使用RIBOmap和STARmap检测了相邻两个脑切片的空间翻译组和空间转录组，并进行整合分析（图4）。结果显示，上述两种方法在基因表达、细胞类型组成和细胞类型的空间分布方面的细胞分型结果一致。

研究团队使用主要细胞类型解析的RIBOmap和STARmap图谱进行了基因聚类，分析了主要细胞类型转录组和翻译组基因表达的关联性，两者关联性越小显示越强的翻译调控。结果显示，所有的非神经细胞类型的关联性都低于神经细胞类型，尤其是少突胶质细胞具有最低的关联性，显示最强的翻译调控。此外，研究团队还发现了数据集中少突胶质细胞的谱系分化路径，从少突胶质前体细胞（OPC）到少突胶质亚型1（OLG1），再到少突神经细胞亚型2（OLG2）。

图4. 小鼠大脑中空间翻译组和转录组的比较。来源：Science

最后，研究团队比较了各个基因的翻译组和转录组在不同脑区的分布特征，定义了转录组和翻译组空间分布特征不一样的基因模块（图5）。与转录组相比，翻译组具有与蛋白质信号更一致的空间分布特征。这一结果验证了一些基因存在脑区特异性翻译调控，证明了RIBOmap可用于研究小鼠脑组织神经元和神经胶质细胞过程中的亚细胞定位翻译。

图5. 小鼠脑亚细胞定位的mRNA翻译。来源：Science

综上所述，RIBOmap是一种新的单细胞和分子分辨率的空间翻译组测序技术，加速了人们在亚细胞结构、细胞类型和组织解剖学背景下对蛋白质合成的理解。成对的空间翻译组和转录组图谱使人们能够系统地识别细胞类型和组织区域特异性翻译调控，为揭示新的转录后基因调控原理和机制铺平道路。此外，RIBOmap技术还避免了复杂的多体分离步骤和基因操作，在后期研究人体组织和疾病样本方面颇具前景。

参考文献：

Zeng H, Huang J, Ren J, et al. Spatially resolved single-cell translatomics at molecular resolution. Science. 2023;380(6652):eadd3067. doi:10.1126/science.add3067