Kidney Int 山东大学齐鲁医院张澄教授/张运院士/张猛教授团队揭示旁斑蛋白NONO在血管钙化中的作用及机制

人体中99%的钙以羟基磷灰石的形式存在于骨骼和牙齿中，当羟基磷灰石异位沉积在血管壁时，则产生血管钙化的病理过程。血管钙化常与糖尿病、慢性肾脏病(CKD)和衰老相关，表现为动脉壁的进行性硬化和顺应性下降，可导致脉压升高、心脏后负荷增加，进而诱发心力衰竭、肝、脑、肾等高流量器官的灌注障碍和慢性下肢缺血的发生。流行病学研究证明，血管钙化是CKD患者心血管发病率和死亡率的独立危险因素，但目前仍缺乏有效的干预手段。因此，探索血管钙化的发病机制和干预靶点具有重要的临床意义。

旁斑是一种存在于哺乳动物细胞核染色质间隙中的亚核小体。NONO作为旁斑的核心蛋白成分，同时拥有DNA和RNA的结合结构域，几乎参与基因调控的每个过程，包括转录调控、RNA加工和运输以及DNA修复等，因而具有广泛的生物学功能。既往研究表明，NONO通过抑制P4Hα1的表达影响胶原的成熟与分泌，提示NONO与血管细胞外基质(ECM)的重构存在一定联系。然而，在ECM重构相关性疾病血管钙化中，NONO的作用尚无报道。

2024年2月26日，山东大学齐鲁医院心内科、络病理论创新转化全国重点实验室张澄教授/张运院士/张猛教授团队在Kidney International在线发表了题为“Paraspeckle protein NONO attenuates vascular calcification by inhibiting bone morphogenetic protein 2 transcription”的研究论文，阐述了NONO抑制血管平滑肌细胞(VSMC)成骨分化和血管钙化的作用及机制，为血管钙化的干预手段的研究提供了潜在靶标。

首先，为了明确NONO在血管钙化中是否发挥作用，课题组收集了CKD患者的冠状动脉组织，行茜素红染色确定其血管钙化的病理改变后检测NONO的表达变化。结果发现，与对照组相比，CKD患者钙化血管中NONO表达显著降低。由于血管钙化是一个复杂的病理过程，受年龄、内分泌、脂质、钙磷代谢等多种因素的影响，使用单一的动物模型难以模拟人体中血管钙化的临床表型。因此，在此研究中，课题组同时使用了3种小鼠模型来模拟血管钙化的病理过程，分别是5/6肾切除术联合高磷饮食喂养诱导的慢性肾衰模型、高腺嘌呤饮食喂养诱导的慢性肾衰模型和皮下注射维生素D诱导的急性血管钙化模型。结果显示，与各自的对照组相比，造模组小鼠主动脉中NONO的表达水平均呈下降趋势。在细胞水平，高磷刺激时间依赖性地下调VSMC中NONO的表达水平。以上结果提示，NONO可能参与了血管钙化的发生发展。

为了进一步明确NONO在血管钙化中的作用，课题组构建了血管平滑肌细胞特异性NONO基因敲除(NONO^SMKO)小鼠，并在NONO^SMKO小鼠和同窝对照小鼠中分别诱导3种血管钙化模型。血清生化检测显示，造模组小鼠肾功能损伤，并出现不同程度的钙磷代谢紊乱。对小鼠主动脉弓段行茜素红染色及Von kossa染色以评估钙盐沉积情况，结果显示，与各自的对照组相比，造模组小鼠主动脉钙盐沉积增多，血管壁钙结节分布密集，而敲除NONO进一步加重了这些现象，钙含量和碱性磷酸酶活性检测也显示了相似的结果。同时，分子生物学及病理染色检测提示，NONO敲除加重了钙化小鼠主动脉VSMC的成骨分化和凋亡。以上结果表明，VSMC特异性NONO敲除加重了小鼠的血管钙化。

矿物质平衡失调和磷酸盐水平升高是CKD血管钙化的关键决定因素，研究表明，体外使用与高磷血症患者水平相当的磷酸盐可诱导VSMC发生成骨分化和钙化。为了明确NONO对VSMC功能的影响，课题组从NONO^SMKO小鼠和同窝对照小鼠体内分别提取原代VSMC，并给予高磷刺激。结果显示，NONO基因敲除可加重高磷诱导的VSMC成骨分化、凋亡和钙盐沉积。与此同时，在VSMC中使用腺病毒过表达NONO，随后分别给予高磷刺激和对照溶剂，结果显示，NONO过表达可显著减轻高磷诱导的VSMC成骨分化、凋亡和钙盐沉积。

为了在体外实验中模拟体内环境，课题组进行了离体主动脉环实验，分别提取NONO^SMKO小鼠和同窝对照小鼠的主动脉环进行培养并给予高磷刺激，钙化染色及钙含量检测显示，NONO敲除加重了小鼠主动脉环的钙化水平，这一结果与体内和体外实验结果相一致。

为了深入探索NONO调控VSMC成骨分化和血管钙化的具体机制，课题组对敲除NONO基因的VSMC进行了转录组测序，筛选出了关键分子BMP2。进一步研究表明，NONO的表达与BMP2的表达呈明显负相关，提示NONO可能负调控BMP2的表达。MGP可通过拮抗BMP2的活性而起到抗血管钙化的作用，RT-PCR结果显示，高磷刺激下NONO不影响MGP的表达，表明NONO对BMP2的调控不依赖于MGP。NONO可作为DNA/RNA结合蛋白在转录水平或转录后水平发挥作用，通过检测BMP2的mRNA半衰期，发现NONO敲减不影响BMP2 mRNA的稳定性，提示NONO可能在转录水平调控BMP2基因的表达。通过双荧光素酶报告基因实验，课题组发现，NONO显著抑制了BMP2的转录活性。为进一步明确调控BMP2转录的NONO结构域，课题组构建了不同NONO结构域缺失的突变体，通过双荧光素酶报告基因实验证明，NONO的羧基端对BMP2的转录发挥调节作用。为了明确BMP2启动子上NONO结合的靶序列，课题组对BMP2启动子设计了一系列截短突变体，根据双荧光素酶报告基因实验及既往文献的报道，将BMP2启动子上-632到-420段的CATAAAT序列锁定为靶序列，随后通过染色质免疫共沉淀实验证明了NONO与此序列的结合。以上结果表明，NONO通过其羧基端与BMP2启动子上的CATAAAT序列结合，抑制了BMP2基因的转录。

综上所述，该研究发现，NONO作为负调控因子在血管钙化中发挥了重要作用。NONO通过其羧基端与BMP2启动子上的CATAAAT序列结合，抑制了BMP2的转录，而NONO敲除解除了其对BMP2的转录抑制作用，加速了VSMC的成骨分化和血管钙化的发生，这些发现为血管钙化的预防和治疗提供了潜在的新靶点。

该论文的第一作者是山东大学齐鲁医院心内科博士研究生卢悦，山东大学齐鲁医院心内科张澄教授、张运院士和张猛教授为该论文的共同通讯作者。山东大学齐鲁医院为第一和通讯作者单位。

原文链接：

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38417578/