【综述】程序性坏死在缺血性卒中中的研究进展

摘要：程序性坏死是一种受调控的,依赖于受体相互作用蛋白激酶(RIPK)1､RIPK3和混合系列蛋白激酶结构域样蛋白(MLKL)激活介导的炎性细胞死亡机制,该细胞死亡形式与多种疾病相关｡研究显示,程序性坏死在缺血性卒中发生和发展过程中发挥重要作用｡该文回顾了程序性坏死的发生机制,并阐述了其在缺血性卒中疾病过程中的调控机制,以期为干预缺血性卒中的发生和进展提供新的靶点｡

程序性死亡是指细胞遇到内､外环境因子刺激时,受基因调控主动有序的死亡方式,通过这种方式消除受损､衰老或不必要的细胞来维持细胞内外环境稳定,程序性死亡可分为凋亡､自噬､程序性坏死､焦亡､铁死亡等形式｡程序性坏死(necroptosis)于2005年由Degterev等研究发现,这种死亡形式不同于以往的认识,其与凋亡相似可受到精密信号通路的调控,但因可介导炎性反应而区别于凋亡｡研究表明,对程序性坏死进行干预可治疗多种疾病,而越来越多的证据显示,程序性坏死与缺血性卒中在病理生理方面具有相关性｡目前国内外关于程序性坏死与缺血性卒中关系的综述较少,现就程序性坏死的特征及其在缺血性卒中中的作用进行综述｡

1 程序性坏死的特征

程序性坏死作为一种可被调控的细胞坏死模式,可通过肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factorreceptor,TNFR)､Toll样受体､死亡受体､依赖于DNA的干扰素激活物等受体介导的通路发生,程序性坏死信号通路主要由受体相互作用蛋白激酶(receptor interaction protein kinase, RIPK)1､RIPK3 和混合系列蛋白激酶结构域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)调控｡以最常见的TNFR通路为例,当肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)与受体结合后激活胞内的TNFR 相关死亡结构域(TNF receptor associated death domain, TRADD)与RIPK1､胞内凋亡蛋白抑制因子1 和线性泛素链组合体复合物组合成复合体Ⅰ ｡正常的复合体Ⅰ 有维持细胞存活的作用,若复合体Ⅰ 内的RIPK1 和TRADD发生脱离,可以与Fas相关死亡结构域蛋白结合成新的复合体Ⅱ a,复合体Ⅱ a通过招募含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶8(cysteinylaspartate specific proteinase-8, Caspase-8)激活Caspase信号通路诱导细胞凋亡｡如果在病理或实验条件下,复合体Ⅱ a 中的Caspase-8 被抑制造成RIPK1 和RIPK3结合形成复合体Ⅱ b,复合体Ⅱ b招募磷酸化的MLKL形成坏死复合体,磷酸化后的MLKL寡聚体最终可从胞质转移到细胞膜上,导致胞膜的完整性被破坏,造成坏死｡见图1｡

程序性坏死被认为是一种高度促炎的死亡模式,细胞膜被破坏后细胞释放一系列内源性分子引发炎性反应,这些内源性分子属于应激及损伤组织细胞释放的危险相关分子模式(damage associated molecular patterns, DAMPs),DAMPs与细胞外液一起通过胞饮作用被抗原呈递细胞摄取后分泌多种促炎细胞因子[如白细胞介素1(IL-1)､IL-6､IL-12､IL-23和γ干扰素和趋化因子C-C基元配体2､CXC趋化因子配体9(CXC chemokine ligand 9,CXCL9)和CXCL10]来招募相关免疫细胞到坏死部位产生炎性反应｡

2 程序性坏死在缺血性卒中中的作用

2. 1 程序性坏死对动脉粥样硬化的影响

动脉粥样硬化是缺血性卒中最常见的原因之一,当血管内皮受损或在炎性反应的作用下,脂质微粒侵入动脉壁并沉积于动脉内膜,损伤的内皮细胞分泌诱导因子吸引血液中的单核细胞聚集,单核细胞黏附内皮并迁入到内皮下间隙吞噬脂质成为泡沫细胞,泡沫细胞出现凋亡､坏死形成脂核后成为粥样斑块｡目前研究认为,具有薄纤维帽和较大坏死核(大于1 mm2)的斑块为“易损斑块”,而程序性坏死参与了坏死核形成的过程｡Lin 等研究表明,与RIPK3基因未敲除的低密度脂蛋白受体敲除小鼠相比,RIPK3 基因敲除的低密度脂蛋白受体敲除小鼠动脉粥样硬化斑块面积更小(P < 0. 05),且RIPK3基因敲除的低密度脂蛋白受体敲除小鼠的坏死核平均面积较对照组减少约60%(P < 0. 05),在电镜下进一步观测到,RIPK3 基因敲除的低密度脂蛋白受体敲除小鼠斑块中出现程序性坏死巨噬细胞数的量较RIPK3基因未敲除的低密度脂蛋白受体敲除小鼠减少了约50%(P < 0. 05),程序性坏死的巨噬细胞减少减缓了动脉粥样硬化易损斑块形成,从而提升斑块稳定性｡Rasheed等在载脂蛋白E敲除小鼠中也有类似的发现,MLKL 为RIPK1 和RIPK3下游启动程序性坏死的关键蛋白,利用反义寡核苷酸调控MLKL蛋白表达的小鼠斑块坏死核面积较未抑制MLKL蛋白表达的小鼠减少超过50%(P < 0. 05),提示MLKL作为程序性坏死的调控蛋白在动脉粥样硬化易损斑块形成中发挥重要作用｡Karunakaran等通过分析人类颈动脉内膜切除术样本生物库(Biobank of Karolinska Endarterectomy,BiKE)中127份经过免疫组化分析的颈动脉狭窄患者斑块发现,相较于正常颈动脉样本,颈动脉斑块中负责调控RIPK3和MLKL的信使核糖核酸表达增加(P < 0. 01),进一步比较发现,易损斑块中调控RIPK3和MLKL的信使核糖核酸表达均高于稳定斑块(P值分别为0. 0279､0. 0043)｡以上研究表明,程序性坏死在动脉粥样硬化斑块形成和进展中发挥作用｡

2. 2 程序性坏死与缺血-再灌注损伤

静脉溶栓和机械取栓可以实现缺血性卒中患者脑组织的血流再灌注,虽然再灌注血流可以增加缺血区的血液供应,但也可促进氧化应激和炎性反应,导致神经细胞损伤加重,这种现象被称为脑缺血-再灌注损伤｡研究表明,程序性坏死是导致脑缺血-再灌注损伤的机制之一｡在体外氧糖剥夺后复氧(oxygen and glucose deprivation followed by reoxygenation,OGD / R)神经细胞模型中测定程序性坏死相关蛋白水平发现,将神经细胞置于37 ℃､95% N2 + 5% CO2 的厌氧环境中孵育2 h,然后将神经细胞转移到37 ℃､21% O2 + 5% CO2 常氧环境下继续孵育48 h 后,神经细胞的RIPK1､RIPK3 和MLKL蛋白浓度较常氧环境下表达均升高(均P <0. 05)｡Chen 等将少突胶质前体细胞置于37 ℃的95% N2 + 5% CO2 的厌氧环境中培养2 h,再转移到常氧环境(21% O2 + 5% CO2),结果显示,相较于常氧环境中培养的少突胶质前体细胞,缺氧再复氧少突胶质前体细胞的RIPK1 蛋白浓度在复氧6 h 后开始表达增加(P < 0. 05),而RIPK3 和MLKL分别在复氧12 h和24 h后开始表达增加(P <0. 05)｡此外,有体外细胞实验显示,不同细胞种类出现程序性坏死的时间不同,Mitroshina等的研究结果提示,神经细胞出现程序性坏死早于星形胶质细胞｡相较于体外实验,RIPK1､RIPK3 和MLKL在体内更早发生变化,Vieira等在研究中通过从小鼠右侧颈总动脉引入尼龙线至同侧大脑中动脉,阻断小鼠大脑中动脉供血,15 min后抽出尼龙线恢复脑灌注,相较于假手术组,实验组小鼠再灌注1 h后海马CA1区RIPK3蛋白水平升高(P < 0. 05),大脑中动脉持续阻塞小鼠缺血模型的脑组织分别在缺血3 h和12 h可检测到RIPK1和RIPK3蛋白水平升高(均P < 0. 01)｡多项体内实验结果表明,缺血-再灌注后出现程序性坏死一般早于持续缺血,且相较于正常对照组,RIPK1､RIPK3､MLKL蛋白的浓度随着缺血-再灌注时间延长而升高,再灌注后72 h程序性坏死蛋白表达增高最明显｡综上可知,缺血-再灌注后较持续缺血更容易诱发程序性坏死,因此尽早在脑缺血-再灌注治疗后进行程序性坏死的靶点干预显得尤为重要｡

3 程序性坏死作为治疗干预靶点

3. 1 程序性坏死的药物干预

细胞实验和动物研究均显示,使用程序性坏死抑制剂能对缺血性卒中起到防治作用｡坏死抑制素1s(necrostatin-1s,Nec-1s)是最早被发现的RIPK1激酶抑制剂。Chen 等在OGD/ R 神经细胞模型中使用Nec-1s后发现,药物干预组RIPK1､RIPK3､MLKL 均低于OGD/ R 安慰剂组(均P <0. 05,因此认为Nec-1s可能具有神经保护作用｡而Nec-1s作用于载脂蛋白E敲除小鼠可使其动脉斑块坏死核面积减少62%,同时相较于载脂蛋白E敲除的安慰剂组,Nec-1s干预后可使其斑块中血管平滑肌细胞的数量增加70%(均P < 0. 05),因此该研究认为,Nec-1s可以提升动脉粥样斑块的稳定性。Yang等在大鼠缺血前1 h脑室注射Nec-1s,结果显示,其脑缺血-再灌注损伤后,海马CA1 区长度为1 mm的脑组织中椎体细胞存活数为缺血前安慰剂MLKL蛋白浓度较常氧环境下表达均升高(均P <0.05)。Chen 等将少突胶质前体细胞置于37 ℃的95% N2 + 5% CO2 的厌氧环境中培养2 h,再转移到常氧环境(21% O2 + 5% CO2),结果显示,相较于常氧环境中培养的少突胶质前体细胞,缺氧再复氧少突胶质前体细胞的RIPK1 蛋白浓度在复氧6 h 后开始表达增加(P < 0. 05),而RIPK3 和MLKL分别在复氧12 h和24 h后开始表达增加(P <0. 05)｡此外,有体外细胞实验显示,不同细胞种类出现程序性坏死的时间不同,Mitroshina等的研究结果提示,神经细胞出现程序性坏死早于星形胶质细胞｡相较于体外实验,RIPK1､RIPK3 和MLKL在体内更早发生变化,Vieira等在研究中通过从小鼠右侧颈总动脉引入尼龙线至同侧大脑中动脉,阻断小鼠大脑中动脉供血,15 min后抽出尼龙线恢复脑灌注,相较于假手术组,实验组小鼠再灌注1 h后海马CA1区RIPK3蛋白水平升高(P < 0. 05),大脑中动脉持续阻塞小鼠缺血模型的脑组织分别在缺血3 h和12 h可检测到RIPK1和RIPK3蛋白水平升高(均P < 0. 01)。多项体内实验结果表明,缺血-再灌注后出现程序性坏死一般早于持续缺血,且相较于正常对照组,RIPK1､RIPK3､MLKL蛋白的浓度随着缺血-再灌注时间延长而升高,再灌注后72 h程序性坏死蛋白表达增高最明显。综上可知,缺血-再灌注后较持续缺血更容易诱发程序性坏死,因此尽早在脑缺血-再灌注治疗后进行程序性坏死的靶点干预显得尤为重要｡

3. 2 程序性坏死的其他干预手段

已有研究报道,在小鼠模型中敲除或转染程序性坏死相关基因可达到治疗脑梗死的效果｡Naito等研究显示,RIPK3 基因敲除后小鼠缺血-再灌注后的梗死体积较野生型小鼠脑缺血-再灌注后的梗死体积小(P = 0. 02)｡而Newton等的研究结果显示,RIPK3基因敲除鼠缺血-再灌注病灶处CCL5趋化因子较野生型鼠减少(P < 0. 01)｡由于颗粒蛋白前体具有抑制程序性坏死的作用,因此颗粒蛋白前体也可能是未来治疗脑缺血-再灌注损伤新的治疗手段,Li等将腺病毒作为颗粒蛋白前体的载体注射入大脑中动脉闭塞后再灌注小鼠的大脑观察到,再灌注72 h后颗粒蛋白前体治疗组小鼠较安慰剂对照组脑梗死体积更小(P < 0. 05),同时颗粒蛋白前体治疗组小鼠的RIPK1､RIPK3 和MLKL表达较安慰剂对照组减少(均P < 0. 01),颗粒蛋白前体治疗组小鼠72 h后神经功能缺损评分较安慰剂对照组明显改善[(1. 89 ± 0. 62)分比(4. 74 ± 0. 22)分,P < 0. 05];另外Li等进一步研究发现,颗粒蛋白前体治疗后灶周活性氧较安慰剂对照组减少(P <0. 01),研究认为,颗粒蛋白前体具有抑制程序性坏死达到减少灶周活性氧产生的作用｡此前有国内研究者报道,吸入高浓度氢气(42 % H 2 -21 % O2 -37% N2)对脑缺血-再灌注损伤有改善作用,但大规模的高浓度氢气制备与储存在临床实际应用过程中存在困难｡Zhan等采用的低氧预适应临床实施难度相对较小,将大鼠放置于8% O2 和92% N2 构成的环境中30 min进行低氧预适应,24 h后对大鼠颈动脉进行10 min夹闭后恢复血流,结果显示,低氧预适应组大鼠较常氧环境组脑缺血-再灌注后海马CA1区的神经细胞死亡更少(P < 0. 05),RIPK3 的表达水平更低(P < 0. 05),因此,该研究认为低氧预适应可抑制程序性坏死达到神经保护的作用｡相比于药物治疗,这些新的技术手段可能具有更好的干预效果以及更低的毒副作用,但目前这些方法仍处于体外细胞和动物实验阶段｡

4 小结

综上所述,程序性坏死参与了缺血性卒中形成和进展的多个环节,通过干预程序性坏死这一作用靶点可有效地控制动脉斑块进展,同时也可以减少脑缺血再灌注损伤后的神经损伤｡因此抑制程序性坏死可能是未来预防及治疗缺血性卒中的新靶点｡