孕妇血浆cfDNA遗传去卷积分析实现胎儿染色体异常和单基因病的同步筛查

导读

NIPT是筛查常见胎儿染色体非整倍体和染色体微缺失微重复综合征最有效的技术手段。但NIPT在检测疾病范围、目标疾病的检测性能等方面还有较大的提升空间，亟需对NIPT这一重要临床检测技术进行实验方法学和分析算法的创新突破，以拓展NIPT筛查疾病范围（如单基因遗传病）并大幅提升目前检测难点疾病的检测性能。

2022年10月13日，复旦大学附属妇产科医院和博昊基因等单位牵头，由黄荷凤院士、徐晨明、吴琰婷、张静澜为共同通讯作者的团队在Cell Discovery期刊上发表了其新一代NIPT的研究成果，通过创新性探针设计、无偏好的cfDNA等位基因靶向富集、RD（高通量测序reads深度）和AF（等位基因频率）数据同时分析染色体拷贝数和目标位点基因型的创新生信算法等，实现了对胎儿染色体非整倍体、染色体微缺失微重复和单基因遗传病的同步准确的无创产前检测。据悉，与该论文相关的一项历时近2年的多中心前瞻性临床研究也完成了入组、随访、数据分析和结题，即将形成科研成果；该技术的产业化产品NIPT2 Pro也同步推出。论文审稿人评价说：“总体而言，本文在NIPT技术发展方面取得了重大进展，具有重要的科学发现和临床意义”。

引言 

约3-5%的活产儿存在出生缺陷，约15-25%的出生缺陷是由遗传性疾病导致的，其中大多数没有有效的治疗方法。在过去十年中，全世界都在广泛使用无创产前检测（NIPT）筛查常见的胎儿染色体非整倍体。最近，NIPT已扩展到筛查胎儿染色体微缺失和微重复综合征（MMS）。

由于母体血浆中大部分cfDNA来源于母亲，高母体背景下检测胎儿特有变异有困难，许多遗传性疾病NIPT还无法检测。为应对海量的遗传性出生缺陷，亟需开发一项全面的可同時筛查染色体及单基因病的NIPT检测。

黄荷凤院士团队联合博昊基因等单位在Cell Discovery期刊（IF38.079）发表文章“Genetic deconvolution of fetal and maternal cell-free DNA in maternal plasma enables next- generation non-invasive prenatal screening”。研究团队提出了一种创新的NIPT方法：协同等位基因靶向富集测序（COATE-seq）。COATE-seq采用无偏好的等位基因靶向富集，可全面分析胎儿染色体非整倍体、MMS和单基因病。研究结果显示，在入组的1129例妊娠样本中，COATE-seq检测到54个胎儿非整倍体、8个MMS和8个单基因变异，灵敏度为100%，特异度为99.3%。利用开发的综合cfDNA基因组分析工具，研究发现60.3%的非整倍体样本有异常的减数分裂重组。

据文章介绍，COATE-seq方法使用高深度测序来分析与三种不同类型遗传病相关的基因组区域，检测分辨率从单碱基到整个染色体的拷贝数改变。此外，该方法通过分析与母体/胎儿基因型、reads深度、SNP连锁和cfDNA片段长度相关的NGS数据，对母体血浆中胎儿和母体的混合cfDNA进行了遗传去卷积。这种新的NIPT检测方法通过对基因组信息的多维分析，可成功识别并排除NIPT常见干扰因素，包括多胎妊娠、母体拷贝数变异（CNV）和杂合性丢失（AOH），从而提高了检测性能。此外，COATE-seq还可识别胎儿特有的基因组特征，包括cfDNA片段长度、减数分裂错误起源、减数分裂重组和重组断点，从而从不同层面实现了对胎儿变异的特异性评估。该研究首次报道了在胎儿游离DNA中检测到与非整倍体相关的染色体重组异常现象，为人类非整倍体的起源研究提供了新的重要技术手段。

研究结果 

COATE-seq可以抑制等位基因杂交偏好

数据显示，在基于杂交的靶向富集中，COATE-seq的等位基因偏好比传统探针（CON-seq；图1c-e）要小。在进行COATE-seq时，所有母体杂合位点的等位基因频率（AF）中位数显著升高，并接近0.5（图1c，d）。在COATE-seq中，胎儿变异的AF变异系数（CV）也显著降低（图1e）。此外，COATE-seq基于SNP方法的系数相关性高于CON-seq（图1f，g）。同时，当使用母亲纯合位点上的胎儿杂合SNP作为参考或变异等位基因时，COATE-seq估算胎儿分数产生的偏差较小。总的来说，COATE-seq对胎儿SNP AF的定量比传统方法更准确，这对提高NIPT检测染色体变异的信噪比至关重要。

图1 COATE-seq抑制等位基因杂交偏好

a 通过液相杂交富集目标区域。探针和目标片段配对是一个可逆的过程，有一个平衡常数。与目标序列互补的探针（K）的平衡常数大于变异序列（K'）。b 与传统（CON）探针不同，COATE探针不区分参考和替代等位基因，因此KCOATE和K’COATE之间的差异小于KCON和K’CON。c 杂交温度为65℃时，使用COATE探针，孕妇血浆样本母体杂合位点的CAF（中心等位基因频率）明显升高，接近0.5。d 杂交温度为68℃时，等位基因偏好的减少显著。e 杂交温度为65℃时，比较了COATE-seq和CON-seq（分别由COATE和传统探针进行富集）AFs的CV。使用COATE-seq和CON-seq在母亲（BB）纯合、替代等位基因（AA）纯合和杂合（AB）位点上CV的比值。c-e使用t检验进行比较；*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001, ****P < 0.0001. f, g 使用COATE-seq和CON-seq方法计算FF的比较。基于SNP和经典Y染色体法计算102例男胎妊娠的FF。

多维cfDNA分析用于检测胎儿染色体拷贝数变异

研究团队开发了通过RD（reads深度）和AF（等位基因频率）数据来同时分析染色体剂量和基因型的算法，这种新算法可以在检测胎儿变异之前检测到双卵双胎妊娠以及母体CNV和AOH，并将其作为质量控制步骤，减少分析错误（图2a）。

在用于分析验证的419个样本中，有17个（4.1%）存在≥200kb的母体CNV，10个（2.4%）存在≥75个连续纯合位点的母体AOH区域，以及10个（2.4%）多胎妊娠或非妊娠（图3）。将≥3Mb的母体CNV、母体染色体AOH减少杂合SNP位点和非单胎妊娠等混杂因素纳入考虑后，基于RD的分析可检测到除1个18三体外的所有非整倍体，检测灵敏度为97.5%，阳性预测值（PPV）为84.8%。基于AF的方法检测出40个非整倍体中的34个，灵敏度为85.0%，PPV为91.9%。联合RD和AF方法检测出所有非整倍体，灵敏度为100%，PPV为80.0%（图2）。以上结果表明，联合使用RD和AF数据比单独使用一种方法具有更高的检测灵敏度。

图2 RD分析和AF分析联用检测胎儿染色体畸变

a 胎儿染色体病的检测采用SNP AF和RD联合分析。Lv1质控包括检测RD、FF、多胎妊娠和母体CNV。通过Lv1质控的样本要进行基于RD的染色体分析。Lv2质控包括检测母体AOH，并计算胎儿杂合而母亲纯合位点的数量。通过Lv1和Lv2质控的样本进行基于SNP AF的染色体分析。b-g常见非整倍体和MMS的结果。每个案例包含SNP AF（左图）和SNP深度（右图）的结果。b-g，不同染色体的SNP位点颜色不同，有chr13、chr18、chr21和chrX等。chr22的SNP与DiGeorge综合征相关。chrRef的SNPs包括chr13、chr18、chr21、chr22、chrX和chrY之外的参考SNPs（见材料和方法）。（b）由MI NDJ导致的T21病例。（c）由PI NDJ导致的T21病例。（d）MII型NDJ的T18病例。（e）PII型NDJ的T13病例。（f）22q11.2微缺失病例，母系chr22片段缺失。h, i 不同分析方法的敏感度（h）和PPV（i）值。条形图为95%CI。AF，等位基因频率；RD，reads深度；RD&AF，RD和AF的联合分析；CI，置信区间；PPV，阳性预测值；MMS，微缺失/微重复综合征；SNP，单核苷酸多态性；PCA，主成分分析；CAF，中心等位基因频率；QC，质量控制；Lv1，1级；Lv2，2级；FF，胎儿分数。

图3 胎儿和母体游离DNA的遗传去卷积可以排除母体干扰

a-c 母体CNV典型案例，母体CNV由SNP AF和RD变化提示，包括一个~3.1 Mb的重复（a），一个~0.35 Mb的重复（b），和一个~0.5 Mb的重复（c）。d-f AOH典型案例，母体AOH仅由SNP AF变化提示，包括一个Chr21~3.2 Mb的AOH区域（d），一个Chr18~16 Mb的AOH区域（e），和一个chr22~ 3.1 Mb的AOH区域。g 典型的双胎妊娠案例，胎儿SNP及AF的波动范围都增加了。h 多胎或未妊娠的案例，在chr13、chr18、chr21、chr22和chrX上检测到母体CNV（大小>200kb）或母体AOH（≥75个连续同源SNP）案例的占比。探针基本覆盖了chr13、chr18、chr21和chrX整个区域。chr22的SNPs与DiGeorge综合征相关（chr22：17,322,843-21,118,912，见材料和方法）。CNV，拷贝数变异；SNP，单核苷酸多态性；AOH，杂合性丢失；AF，等位基因频率；RD，reads深度。

通过分析胎儿cfDNA确定染色体重组和减数分裂不分离的起源

在33组由匹配的胎儿、母体DNA及二者混合物组成的样本中，研究团队检测了混合DNA中的染色体重组，并通过连锁SNPs在胎儿基因组中进行了验证（图4a-c）。在73个非整倍体样本中，有44/73（60.3%，25个T21，9个T18，10个T13）检测到重组（图4h）。在验证集中，把重组纳入考虑时，AF方法可识别34/40（85.0%）的非整倍体，如果不考虑交叉重组，检测率下降到67.5%（图2h）。

与减数分裂错误起源相关的交叉重组分析显示，在47例21三体综合征中，大多数不分离（NDJ）错误发生在母系第一次减数分裂（MI NDJ，63.8%），其余分别发生在母系第二次减数分裂（MII NDJ，27.7%）、父系第一次减数分裂（PI NDJ，2.1%）和父系第二次减数分裂（PII NDJ，6.4%）（图4g）。18三体病例中MII（57.1%）错误占主导地位，13三体病例中MI（50.0%）和MII（41.7%）基本相当（图4g）。总的来说，研究发现21三体病例中可检测到的重组多为MI中的单一交叉重组，在18和13三体中，有两个或多个交叉重组的病例更多。以上数据表明，新NIPT方法在描述常见非整倍体的减数分裂错误和交叉重组的起源方面是非常准确的。

图4 胎儿cfDNA研究发现了减数分裂不分离的起源和非整倍体相关的同源重组

a-c 一个使用母子配对混合DNA的T21病例，发现同源重组。存在两种不同AF模式推断出重组（a）。在羊水细胞中，只在chr21的端粒区域检测到纯合SNP（BBB或AAA）（b）。母亲是杂合子的位点，胎儿是纯合（AAA或BBB），与MII NDJ一致。绘制了每个位点减数分裂错误的概率（c）。当胎儿为杂合（ABB或AAB）时，假设MI和MII NDJ的发生率相同，则MI NDJ的先验概率为2/3，而MII NDJ的先验概率为1/3。虚线表示MI和MII SNP模式的过渡，说明存在交叉重组。d-f 怀有T13胎儿孕妇的cfDNA显示了胎儿基因组的SNP模式（e）和减数分裂错误概率（f）。虚线表示MI和MII SNP模式的过渡，说明有两个交叉重组。g 检测到的减数分裂错误的占比。h 检测到重组的非整倍体病例的占比。i 不同类型的减数分裂NDJ相关的交叉重组的数量。

基于胎儿cfDNA片段特征，改进对胎儿新发和父系遗传的单基因变异检测方法

研究团队开发了一种新的多维算法来识别新发或父系遗传的胎儿单基因变异（图5a）。将基于变异等位基因reads数的过滤步骤命名为等位基因计数分布（ACD）过滤。研究发现，胎儿的cfDNA片段比母体的对应片段短约10bp，而携带假阳性变异的片段与母体片段的长度相似（图5c）。

研究团队根据胎儿和母体cfDNA片段长度的差异建立了胎儿-母体插入片段长度分布（FMID）过滤，以分辨胎儿变异（图5b）。研究人员检测了28个血浆cfDNA样本及相应的羊水细胞，以分析与单基因病相关的463个基因。当ACD和FMID过滤同时应用时，分析灵敏度和特异性分别为99.5%和99.9%，高于没有过滤或只有ACD过滤的方法。

图5 基于胎儿cfDNA片段特征检测胎儿单基因变异

a 胎儿单基因变异的检测包括ROI分析、ACD过滤和FMID过滤。b 胎儿-母体插入片段长度过滤首先用于排除那些野生型等位基因reads，这些reads片段长度与胎儿突变等位基因reads接近。剩余的野生型等位基因片段与变异型等位基因片段进行长度比较，以确定潜在的胎儿SNV。c 28个测试样本的野生型（ref）和变异型（alt）等位基因支持reads的插入片段分布。对于所有检测到的变异，Ref（RefinsMid）和Alt（AltinsMid）等位基因支持reads的插入片段中位数框图。Ref，野生型/参考基因；Alt，变异；TP，真阳性；FP，假阳性

使用回顾性孕妇血浆样本评估临床有效性

研究团队对1,129个病例的临床数据进行了分析，包括检测指征和妊娠结局（图6），从临床记录中检索所有病例的产前/产后诊断结果，与cfDNA筛查结果比较。在1,129个样本中，77个为阳性，其中70个为真阳性，包括38个21三体，10个18三体，6个13三体，8个MMS，和8个单基因病病例（图6和表1）。共有1052例筛查结果呈阴性。假阴性为0，假阳性病例有7个。这些疾病筛查的综合敏感度和特异度分别为100%和99.3%。验证研究表明，这种新一代NIPT的方法可同时高度准确筛查不同类型的人类遗传性疾病。图6 采用孕妇血浆样本进行临床验证

结语 

通过在妊娠早期同时对单基因病和染色体病进行NIPT检测，可以进行更全面的基因筛查。研究团队建立了一种基于创新的探针杂交捕获的靶向富集方法COATE-seq，弥补了传统方法固有的缺陷：在cfDNA中对等位基因富集偏好和对由测序或实验中产生的噪音影响对低比例胎儿突变的检测。同时，研究团队还开发了基因组算法来分析胎儿cfDNA多维数据，用以检测母体/胎儿的基因型、减数分裂错误起源和减数分裂重组。这种新方法显示了其在临床应用中的潜力，特别是能够对广泛的遗传性疾病进行更准确的产前筛查，为风险评估和及时妊娠管理提供宝贵的信息。