武大张先正/喻爱喜合作《AFM》：多功能3D打印支架改善骨肿瘤化疗免疫治疗，促进成骨！

骨肿瘤切除后肿瘤复发和细菌生物膜形成仍然具有挑战性。然而，这一困境也为生物活性植入物的开发提供了灵感，并为通过生物膜的形成来管理骨肿瘤提供了一条新途径。因此，基于细菌倾向于粘附植入物的特点，武汉大学张先正教授/喻爱喜教授联合设计了用益生菌生物膜修饰的3D打印生物陶瓷支架来增强抗肿瘤免疫。与嗜粘性阿克曼菌相比，鼠李糖乳杆菌GG（LGG）在生物陶瓷上更容易形成生物膜，并被选择用于工程蚀刻生物陶瓷。经过巴氏杀菌处理的LGG生物膜保证良好的生物相容性、增强阿霉素（Dox）负载。此外，LGG生物膜与阿霉素结合，使支架具有直接化疗杀死肿瘤细胞和强免疫激活的多种特性。改良支架能有效抑制小鼠肿瘤模型中的骨肿瘤复发和骨转移。此外，基于3D打印技术，形状可调节的益生菌生物膜修饰支架可以修复肿瘤消除后的形状特异性骨缺损。综上所述，多功能3D打印支架实现了肿瘤消除和骨修复的综合治疗，为骨肿瘤的临床治疗提供了一种很有前途的策略。相关研究内容以题为“Probiotic Biofilm Modified 3D-Printing Scaffolds for Improving Chemo-Immunotherapy of Bone Tumor and Promoting Osteogenesis”的论文于2023年11月17日发表在《Advanced Functional Materials》。

目前，与正常骨成分相似的生物陶瓷（BC）在临床实践中广泛应用于骨缺损修复，且很容易通过3D打印技术设计出来。因此，受植入物上易于生物膜形成、强大的免疫激活和益生菌成骨诱导的启发，本研究设计了一种用LGG生物膜修饰的3D打印蚀刻BC（etBC）支架，并装载阿霉素（Dox）（DL@etBC，示意图），以促进骨肿瘤的化疗免疫治疗。

示意图 益生菌生物膜修饰的3D打印支架为改善骨肿瘤化疗免疫治疗、促进成骨生成

【益生菌生物膜改性etBC的制备及表征】

由于易于粘附和优良的抗肿瘤性能，选择LGG进行后续探索，然而LGG在BC上分布不均匀、稀疏，因此需要进行必要的修改，以获得具有更多LGG涂层和更少微裂纹的L@BC（图1a）。首先通过扫描电子显微镜（SEM）对该改性进行表征（图1b）。对平面进行蚀刻，获得具有明显粗糙度的etBC（图1c）。SEM图像显示，蚀刻1h的etBC形成均匀的生物膜，比裸露BC更少（图1d）。通过CCK-8定量分析，验证了LGG与etBC具有较强的粘附性（图1e）。EDS定位分析显示，碳、氮元素的存在与细菌骨架分布一致（图1f、g），表明LGG成功粘附。通过共聚焦激光扫描显微镜进一步观察到LGG的均匀分布（图1h）。在蚀刻和LGG涂层后，BC、etBC和L@etBC的接触角依次降低，促进细胞粘附，促进随后的骨再生（图1i）。综上，蚀刻法可以显著增加LGG在BC上的涂层。

图1 益生菌生物膜修饰的etBC特性分析

【DL@etBC的制备和表征】

在70°C加热30 min后，用活/死染色法研究LGG的细胞活力，结果表明巴氏杀菌可以完全灭活LGG，保证体内更好的生物相容性，表明其具有很大的生物医学应用潜力（图2a）。与裸etBC相比，生物膜涂层通过嵌入DNA和静电吸附显著增强阿霉素在etBC上的负载（图2b、c）。从而获得DL@etBC。通过体外研究DL@etBC的肿瘤杀伤能力表明，与其他BC相比，DL@etBC具有显著的肿瘤杀伤能力（图2d）。图2e中也显示了LGG辅助Dox加载增强的肿瘤杀伤能力。流式细胞术检测到L@etBC组中较成熟的树突状细胞（图2f）。经过蚀刻和LGG涂层处理后的BC有利于细胞粘附（图2g）。增强的肿瘤杀伤和DC成熟有利于构建负载Dox和益生菌生物膜修饰的3D打印支架（图2h、i），具有高表面积用于体内骨肿瘤治疗。

图2 DL@etBC的体外评价及3D打印BC支架的制备

【etBC支架介导的稳健化疗免疫治疗术后骨肿瘤复发】

对于可切除的肿瘤，肿瘤切除仍然是临床实践中第一个快速、完全切除肿瘤肿块的方案。本研究建立手术切除的皮下肿瘤模型来模拟骨肿瘤的临床管理（图3a）。由于支架上没有或Dox含量较低，没有LGG涂层的支架（BC、etBC、D@BC和D@etBC）处理的肿瘤在第20和30天快速生长（图3b、c）。治疗期间体重无明显波动（图3d），说明BC、etBC和LGG修饰的etBC具有良好的生物相容性。当治疗结束后，采集肿瘤组织（图3e）。在其他组中观察到更多细胞核具有大而深染的细胞（图3f），表明DL@etBC支架明显抗肿瘤复发。流式细胞术检测DL@etBC组CD4⁺ T、CD8⁺ T和效应记忆T（TEM）细胞水平升高（图3g），提示有明显的抗肿瘤免疫激活。综上，DL@etBC支架可在切除部位实现显著的化疗免疫治疗，防止术后骨肿瘤复发。

图3 DL@etBC支架对术后肿瘤复发率的体内评价

【DL@etBC支架介导的稳健化疗免疫疗法抑制骨转移】

考虑到将益生菌生物膜修饰的3D打印支架植入小鼠细长腿部的困难，以及尽可能模拟骨微环境，本研究建立另一个肿瘤模型（图4a）。DL@etBC组在骨微环境中可以减缓肿瘤生长，而DL@BC组在再次抵抗肿瘤细胞时具有中度肿瘤抑制作用（图4b、c）。通过体重监测发现这些支架没有明显毒性（图4d）。除DL@etBC组外，其他组均明显可见肿瘤细胞不受控制的生长导致蛀牙和骨破坏（图4e）。Ki67的H&E染色和免疫荧光染色显示其他组的肿瘤细胞呈恶性增殖，而DL@etBC组的肿瘤生长受到控制（图4f）。破骨细胞的减少支了DL@etBC中可以忽略不计的骨破坏（图4g）。流式细胞术检测到引流淋巴结中T细胞增加，特别是CD8⁺ T细胞（图4h）。腿部CD8⁺ T细胞由于免疫功能的系统保护而升高，可打破肿瘤细胞与破骨细胞之间的恶性循环，从而抵抗肿瘤对骨微环境的侵袭（图4i）。综上，益生菌生物膜修饰支架联合局部化疗可赋予肿瘤小鼠系统的免疫保护作用，以抑制骨和远处转移。

图4 DL@etBC支架在骨转移治疗中的体内评价

【L@etBC促进体外成骨分化】

与BC相比，L@etBC促进骨髓间充质干细胞（BMSC）增殖（图5a），说明L@etBC为BMSC的生存和附着提供良好的环境。通过细胞骨架染色可进一步观察到，这可能归因于L@etBC的表面粗糙度和亲水性（图5b）。通过实时定量聚合酶链反应检测到L@etBC处理的BMSC中成骨相关基因（BMP2、OCN、OPN）的mRNA水平显著升高（图5c）。茜素红S染色结果显示，L@etBC可促进BMSC从成骨分化向骨组织形成（图5d）。L@etBC组的OD值高于BC组（图5e）。因此，L@etBC在体外具有更好的生物相容性和显著刺激骨再生的性能。

图5 L@etBC对成骨作用的体外评价

【L@etBC促进体内骨修复】

Micro-CT显示从骨缺损边缘到L@etBC内部的骨组织比BC支架更多，有利于修复大骨缺损（图6a）。骨参数结果进一步表明，L@etBC支架具有较好的刺激体内骨再生特性，包括骨体积/组织体积（BV/TV）、骨小梁数（Tb.N）、骨小梁厚度(Tb.Th）和骨小梁分离（Tb.Sp）（图6b）。组织学切片图像显示了从支架边缘到支架中心的新组织的生长模式（图6c、d）。免疫荧光染色证实骨组织生长与血管生成密切相关（图6e）在骨再生阶段，L@etBC组高表达OPN、OCN、BMP2 BSP和RUNX2蛋白（图6f）。以上结果表明，L@etBC可植入骨缺损区域，在骨缺损切除后实现骨修复。

图6 L@etBC对成骨作用的体内评价

【总结】

综上所述，本研究利用益生菌生物膜对蚀刻的3D打印BC进行修饰，构建生物活性植入物，并展示了它们在骨肿瘤管理中的显著潜力。传统金属内固定物无生物活性和抗肿瘤活性，更容易被肿瘤切除腔内的感染性细菌生物膜侵袭，导致植入失败，肿瘤复发。相比之下，用LGG涂层修饰的3D打印植入物，虽然被巴氏杀菌灭活，但仍然对免疫细胞具有生物活性。此外，益生菌生物膜修饰的植入物也可以作为在肿瘤切除腔内局部传递化疗药物的载体。在肿瘤切除腔内介导的局部化疗免疫治疗可直接实现对残余肿瘤的化疗杀伤，并诱导对肿瘤复发和转移的系统免疫保护。此外，益生菌生物膜修饰的植入物也能促进肿瘤消除后的成骨，进一步降低植入物失败和肿瘤复发的风险。总的来说，本研究提出了一种很有前途的策略来设计生物活性植入物，弥补了传统植入物在骨肿瘤管理中的许多缺陷。随着益生菌优点的发现，这一策略也为设计其他生物医学应用的生物活性植入物提供范例。

原文链接：

https://doi.org/10.1002/adfm.202311015