北大口腔王宇光、北京化工大学徐福建/俞丙然AFM：无氧聚阳离子光敏剂有效治疗牙周炎！

牙周组织感染是一种由厌氧菌和兼性厌氧菌等细菌引起的慢性破坏性炎症性疾病。传统的机械清创和抗生素治疗在去除根面生物膜方面效果不佳，导致疾病复发。抗菌光动力疗法(APDT)是一种很有前途的杀菌方法，但它受到氧气含量的限制。北大口腔王宇光&北京化工大学徐福建/俞丙然提出了一种含有光敏剂孟加拉红(RB)和葡聚糖的无氧阳离子聚合物(HQRB-SS-Dex)。它同时释放¹O₂和HO·，在照射下对牙周病原菌表现出很强的抗菌效果。HQRB-SS-Dex的带正电的季铵聚合物和葡聚糖促进了细菌表面的附着和细菌生物膜的渗透，从而允许有效地利用活性氧物种。二硫键使络合物可生物降解，从而提高了生物安全性。本工作提出了一种独特的支化阳离子聚合物，用于无氧APDT，具有潜在的应用于牙周感染的治疗。该研究以题为“Oxygen-Free Polycationic Photosensitizers for Treatment of Periodontal Inflammation”的论文发表在《Advanced Functional Materials》上。

该研究用季铵盐和葡聚糖构建了一种无氧聚合物光敏剂(HQRB-SS-Dex)，以通过APDT潜在地对抗多种口腔细菌。如图1所示，支化阳离子聚合物是通过简单的一锅开环聚合制备的。在光照条件下，HQRB-SS-Dex对牙龈卟啉单胞菌、伴生放线杆菌和兼性厌氧变形链球菌均有杀灭作用。季铵盐和葡聚糖促进了HQRB-SS-Dex在细菌表面的附着和对细菌生物膜的渗透，从而更有效地利用了光敏剂在激光照射下产生的ROS，最终导致细菌死亡和生物膜崩溃。此外，还引入了二硫键，使细胞内的谷胱甘肽(GSH)还原，从而提高了复合体的生物安全性。本研究合成的无氧阳离子聚合物HQRB-SS-Dex为临床APDT治疗牙周疾病提供了一种有前途的策略。

图1. 具有多种功能成分的聚阳离子抗菌剂的合成路线及光动力疗法在牙周炎中的应用示意图

【QRB-SS-Dex的制备与表征】

制备丙胺功能化RB (RB-NH₂)以用作光敏剂，并添加葡聚糖衍生物(Dex-NH₂)以改善生物膜渗透性。羟乙基二硫二缩水甘油醚(HDDE)的二硫键预计会导致GSH依赖性降解成更小的分子。该复合物一起被称为HQRB-SS-Dex。HQRB-SS-Dex在酸性环境中具有良好的稳定性。

图 2. HQRB-SS-Dex的制备与表征

【ROS的产生和抗菌活性】

ROS的产生是导致aPDT效果的关键因素。因此，该研究在确定HQRB-SS-Dex的抗菌活性之前研究了ROS的产生。具体而言，HQRB-SS-Dex在辐照下产生HO·、¹O₂、H₂O₂，ROS释放曲线表明 HQRB-SS-Dex有可能对龈沟中的需氧和厌氧细菌发挥aPDT作用。为了评价其抗菌性能，选择厌氧菌牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线菌和兼性厌氧菌变异链球菌作为牙周病菌的代表菌株，因为它们在牙周炎的发生和发展中发挥着关键作用。结果表明HQRB-SS-Dex表现出广谱抗菌作用。综上所述，这些体外抗菌测定的结果表明HQRB-SS-Dex具有良好的抗菌活性。

图3. ROS的产生和抗菌活性

【生物膜穿透能力】

为了探索基于葡聚糖的聚合物渗透生物膜的能力，将用SYTO 9 green染色的牙龈卟啉单胞菌和变形链球菌生物膜暴露于HQRB、HQRB-SS、HQRB-Dex和HQRB-SS-Dex，采用共焦激光扫描显微镜(CLSM)评价穿透效果。结果表明，葡聚糖成分帮助复合物快速渗透牙龈卟啉单胞菌和变形链球菌生物膜并到达下面的基质。

图4. 生物膜穿透能力

【生物相容性的体外和体内分析】

使用细胞计数试剂盒8(CCK-8)方法测定对培养的人牙龈成纤维细胞(HGF)的细胞毒性，用作 HQRB、HQRB-SS、HQRB-Dex和HQRB-SS-Dex生物相容性的体外测量。结果表明HQRB-SS-Dex产生少量的细胞内ROS，这将减少对宿主细胞的损害。

ROS敏感的荧光探针也被用来研究HQRB-SS-Dex的体内特性，通过使用小动物荧光成像仪来测量经敏化剂和激光照射处理的大鼠牙龈组织中的探针依赖性荧光。在注射HQRB-SS-Dex后的第三天，牙龈组织中的荧光信号显着减少，但是，在HQRB-Dex之后观察到的荧光图案没有减少。总荧光强度的量化进一步证明了牙龈组织中HQRB-SS-Dex的降解。值得注意的是，实验后处死的大鼠主要器官分离组织的苏木精和伊红(H&E)染色支持 HQRB-Dex和HQRB-SS-Dex治疗的生物安全性。

图 5. 生物相容性的体外和体内分析

【牙周组织炎症的体内治疗】

HQRB-SS-Dex强大的抗菌作用和良好的生物安全性激励研究人员进一步研HQRB-SS-Dex的体内抗菌特性。结扎大鼠下颌前牙，并向龈沟内注射牙龈卟啉单胞菌，诱导实验性牙周组织炎症。通过检查牙龈局部区域的放大照片来研究治疗的治疗效果。接受HQRB-SS-Dex处理的大鼠在光照后牙龈没有明显的红肿，而对照组的大鼠则表现出不同程度的炎症反应。采集龈沟液组织，采用平板法评价各组牙周组织中存活的细菌数量。HQRB-SS-Dex经光处理后，细菌完全消失，说明该敏化剂具有高效的体内aPDT效应。

图 6. HQRB-SS-Dex的体内抗炎和抗菌能力

为了探索HQRB-SS-Dex的全身效应，在暴露后第十天对大鼠的主要器官(心、肝、脾、肺和肾)进行组织学分析。主要组织器官未见明显炎症或坏死，具有良好的生物相容性，适合生物应用。此外，炎症对照组的牙龈组织富含炎症细胞，而HQRB-SS-Dex和光处理组的大鼠炎症细胞数量减少。采用免疫组化法检测各组牙龈组织中炎症标志物IL-1β、TNF-α、IL-6的表达水平。代表所有三种蛋白质的强信号出现在炎症对照组的组织切片中。然而，在用 HQRB-SS-Dex和光处理的大鼠分离的组织中，每种蛋白质的信号都很弱；这些组织中的信号与空白对照组的组织中的信号相似。这些结果表明，HQRB-SS-Dex和光激活治疗可减少细菌感染引起的严重免疫反应。因此，HQRB-SS-Dex在牙周组织感染光疗中具有良好的应用潜力。

图 7. 不同治疗后牙周组织的H&E染色和免疫组织化学染色显微照片

【小结】

牙周组织感染是由厌氧和兼性厌氧菌引起的慢性破坏性炎症性疾病。该研究设计了一种在光照条件下发挥光动力效应产生不同类型ROS的方法，可同时杀灭厌氧菌和兼性厌氧菌，提高临床牙周感染的治疗效果。合成了一种阳离子聚合物HQRB-SS-Dex，用于aPDT对抗牙周组织炎症。研究发现该聚合物在光照射下同时释放¹O₂和HO•，并且具有对抗厌氧菌牙龈卟啉单胞菌和兼性厌氧菌变形链球菌的活性。与输氧系统和自供氧系统相比，无氧敏化剂更加可控、温和。带正电荷的季铵和葡聚糖基团帮助HQRB-SS-Dex有效粘附到带负电荷的细菌表面并穿透细菌生物膜。HQRBSS-Dex通过GSH降解二硫键在细胞和组织中分解成更小的分子。最后，体内牙周炎症治疗进一步证实了HQRB-SS-Dex的有效aPDT效果。总之，开发了一种具有多种作用机制的光动力抗菌聚合物来治疗牙周组织疾病。

原文链接：

https://doi.org/10.1002/adfm.202310636