PLoS One：选择性Bruton酪氨酸激酶抑制剂依鲁替尼在Graves眼病患者眼眶成纤维细胞中的治疗效果

背景：Graves眼眶病是Graves病的一种病理表现，Graves病是一种罕见的自身免疫性炎症性疾病。这种自身免疫状态是由促甲状腺激素受体和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)受体自身抗体触发弥漫性自身反应性T细胞和B细胞渗透，导致眼眶炎症。眼眶成纤维细胞由单个核细胞刺激，与GO的发病机制有关。激活的眼眶成纤维细胞的增殖和分化诱导细胞外基质沉积和成脂。GO的这种巨大的软组织增大和重塑导致眼眶周围肿胀、眼球突出、疼痛、复视，以及可能威胁视力的并发症。由于炎症是GO的主要表现之一，糖皮质激素传统上被用作急性炎症期的一线治疗，然而，由于副作用和治疗失败，在分子水平上针对自身免疫过程的新的药物已经被提出。

Bruton‘s酪氨酸激酶(BTK)是一种由BTK基因编码的酪氨酸激酶，在B细胞分化、增殖和存活中起重要作用，在B细胞抗原受体(BCR)信号通路的下游调控中起关键作用。此外，BTK还参与其他信号通路，包括B细胞激活因子受体、趋化因子受体、Toll样受体(TLR)和B细胞和髓系细胞(如巨噬细胞和树突状细胞)中的Fc受体信号。鉴于BTK在几种免疫途径中的广泛作用，靶向BTK的潜在治疗效果目前正在探索中。依鲁替尼最初设计用于治疗类风湿性关节炎小鼠模型，是一种口服生物利用型选择性BTK抑制剂，已被批准用于治疗各种B细胞恶性肿瘤和慢性移植物抗宿主病。此外，依鲁替尼还能逆转动物模型中自身免疫性关节炎和系统性红斑狼疮等疾病的炎症反应。

目的：鉴于BTK在自身免疫性疾病中的基础作用，本研究旨在研究BTK在GO体外模型中的作用。我们研究了BTK在GO组织和正常眼眶组织中的表达水平，并评价了依鲁替尼在原代培养的眼眶成纤维细胞中的抗炎作用。

方法：采用实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测GO患者和正常对照组眼眶组织中BTK基因的表达。将原代培养的眼眶成纤维细胞暴露于依鲁替尼，并用白介素1、β或胰岛素样生长因子-1刺激。用实时荧光定量聚合酶链式反应和酶联免疫吸附试验检测炎症细胞因子的产生。用免疫印迹法检测下游转录因子的表达。

结果：BTK在GO组织中的表达明显高于正常对照组。IL-1β或IGF1刺激GO眼眶成纤维细胞后，BTK mRNA和磷酸化(P)-BTK蛋白的表达也增强。依鲁替尼可降低GO和正常细胞BTK基因和蛋白的表达，抑制IL-1、β和IGF1诱导的促炎细胞因子IL-6、IL-8和COX-2的产生。依鲁替尼还显著抑制IL-1κ刺激的GO细胞和IL-1-β刺激的正常细胞的Akt、p38、c-jun氨基末端激酶、细胞外信号调节激酶和核因子-kappa轻链增强子(NF-κB)的磷酸化。

图1 Bruton酪氨酸激酶(BTK) mRNA在眼眶组织中的表达。使用来自患有Graves眼病(GO) (n = 15)的个体和正常对照(n = 14)的眼眶组织，通过使用实时PCR来评估BTK mRNA的转录水平。结果以中位数和四分位间距表示。(与正常对照组织相比，p<0.05)。

图2 IL-1β和IGF-1对Graves眼病眼眶成纤维细胞Bruton酪氨酸激酶(BTK) mRNA和蛋白表达的影响。评估了随着IL-1β (10 ng/mL)和IGF-1 (10ng/mL)暴露时间的延长(IL-1β和IGF-1均为0-48小时), Graves '眼眶病(GO)成纤维细胞中Bruton酪氨酸激酶(BTK)的转录和磷酸化反应。从每个样品中提取的总RNA (1 μg)通过实时PCR进行逆转录和扩增。(A)用IL-1β处理从GO患者获得的眼眶成纤维细胞。IL-1β处理后BTK mRNA表达增加，在处理后6小时达到高峰(p<0.05)。(B)进行蛋白质印迹分析以评估磷酸化BTK水平的表达水平。IL-1β暴露24小时后，T223结构域磷酸化BTK的相对密度较高，而Y551的磷酸化水平无显著差异(p<0.05)。(C)用IGF-1刺激从GO组织获得的眼眶成纤维细胞，并且在处理后48小时，BTK mRNA表达水平增加(p<0.05)。(D)在IGF-1处理48小时后，Y551结构域磷酸化BTK的相对密度显著增加，而T223结构域磷酸化没有增加(p<0.05)

图3 依鲁替尼对眼眶成纤维细胞活性的影响。将来自Graves眼病受试者的眼眶成纤维细胞接种在24孔培养板中，并用不同浓度(0-10微米)的ibrutinib处理16、24和48小时。浓度为5微米和10微米的依鲁替尼在48小时内显著抑制细胞活力(与对照组相比p<0.05)。使用来自三个不同供体的细胞进行一式两份的MTT测定。结果以未处理对照值的百分比表示，并以平均值±标准偏差表示。

结论：BTK在GO组织和眼眶成纤维细胞中的表达增强。依鲁替尼是一种BTK抑制剂，它抑制促炎细胞因子的产生，并抑制Akt和NFκB蛋白的磷酸化。我们的结果提示BTK在GO炎症发病机制中的潜在作用，并可能成为GO的新的治疗靶点。

原文出处：Park HY,  Chae MK,  Ko J,et al.Therapeutic effect of ibrutinib, a selective Bruton's tyrosine kinase inhibitor, in orbital fibroblasts from patients with Graves' orbitopathy.PLoS One 2022;17(12)