RSC Chem Biol：PROTAC的时代来临——靶向蛋白降解的第3个十年

自2001年证实蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）可通过挟持泛素蛋白酶系统（UPS）调控蛋白功能以来，如今PROTAC已经走过迅速发展的前二十年。早期开发的肽基PROTAC透膜性不佳，越来越多的PROTAC都是基于小分子药物设计而来，用于降解膜蛋白及细胞内蛋白降解。PROTAC取得的成功推动了整个靶向蛋白降解（TPD）领域的发展，降解途径也扩展到溶酶体LYTACs、自噬AUTACs 和 ATTECs等。此文重点关注PROTAC目前表现出的研究趋势，并对未来进行展望。

2004年诺贝尔化学奖颁发给了以色列科学家Aaron Ciechanover、Avram Hershko和美国科学家Irwin Rose，共同表彰其发现细胞通过泛素（Ubiquitin, Ub）调节的蛋白质降解过程清理异常蛋白质的过程。泛素是一类进化保守的小肽，含有76 个氨基酸，大小约8.6 kDa。蛋白质的泛素化修饰涉及泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3的一系列反应。首先在ATP供能的情况下酶E1粘附在泛素分子尾部的Cys残基上使泛素激活, 接着, E1将激活的泛素分子转移到E2酶上,随后, E2酶和不同种类的E3酶共同识别靶蛋白,对其进行泛素化修饰。根据E3与靶蛋白的相对比例，可分为单泛素化修饰和多聚泛素化修饰。

（本图片来源于网络）

基于泛素化的原理，药物化学家早在2001年就提出了PROTAC的概念。通过设计一端是结合靶蛋白的配体，另一端是结合E3泛素连接酶的配体，以一段linker连接，在体内将靶蛋白和E3酶拉近，使靶蛋白被打上泛素标签，然后通过泛素-蛋白酶体途径降解。与小分子抑制剂、抗体的“占位驱动”需要占据靶蛋白的活性位点阻断其功能不同，PROTAC对于靶蛋白的降解属于“事件驱动”，即：只负责触发E3酶与靶蛋白的结合、不需要占位、更不需要抑制靶蛋白。因此，PROTAC对于没有明确的活性口袋的靶点以及大分子抗体不能进入的胞内靶点具有较大的潜力。

PROTAC对于靶蛋白的降解能力与“靶蛋白-PROTAC-E3连接酶”瞬时形成的三元复合物有关。研究发现，尽管有时用于靶向蛋白的配体亲和力不高，但只要能够形成三元复合物，设计出的PROTAC仍然具有较好的降解能力。例如，Crews实验室曾经设计过针对p38α激酶的PROTAC，尽管Foretinib对于p38α激酶的亲和力在10 μM级别，但是设计出的PROTAC对于p38α激酶的降解效果却较好（DC50=210 nM）。PROTAC诱导靶蛋白泛素化后，迅速解离，并参与下一个三元复合物的形成。

PROTACs对于以往观点中难以成药的靶点如支架蛋白FRS2α（2013）、蛋白复合体BAF（2019）、转录因子STAT3（2019）、Ras家族蛋白（2020） 等取得阶段性进展，未来也将会使更多不可成药靶点的降解成为可能。

FRS2α是神经分化过程中重要的支架蛋白，参与神经生长因子NGF介导的MAPK通路。Crews课题早在2013年就尝试设计过能够透膜的肽嵌合体TrkAPPFRS2a，结构包含FRS2α识别的序列及能够被E3连接酶VHL识别的序列，但其发挥作用的浓度高达50 μM以上，效果不尽人意。

 染色质作为真核生物遗传信息的载体，其结构的稳定调节对于DNA复制、转录、基因损伤修复等众多生物学过程至关重要。ATP依赖的染色质重塑复合物BAF/PBAF通过滑移、剔除等方式改变核小体的位置与组成，以实现染色质结构的动态调控，约20%肿瘤的发生均与该复合体发生突变密切相关。研究发现，复合物中两种 ATPase：SMARCA2/4是具有潜力的癌症治疗靶点。研究人员将SMARCA2/4 溴结构域抑制剂通过linker连接VHL E3泛素连接酶配体，形成PROTAC分子成功降解SMARCA2/4，并证明在AML 细胞系中具有抗肿瘤增殖作用。这一结果验证了靶向降解复合物的可能性。

靶向转录因子的药物开发通常受到透膜性及复合物具有过大的蛋白-蛋白相互作用（PPI）表面积导致难以成药的困扰。早在十几年前，能够靶向STAT3 SH2结构域的小分子就已经有过报道，但由于作为抑制剂的低效用及选择性不突出，因此并没有解决实际问题。近日，以STAT3靶向分子SI-109与来那度胺连接形成的PROTAC分子SD-36，能够成功降解白血病细胞系中的STAT3蛋白，并诱导细胞死亡。比较有意思的是，原本选择性并不突出的SI-109分子设计成PROTAC降解剂后选择性也提高。

RAS蛋白突变在25% 的肿瘤中出现，是一个极具潜力的靶点。但是，由于其缺乏有效的口袋以及对GTP的高亲和性导致其在很长一段时间里都作为“不可成药靶点”。近几年针对KRAS G12C突变设计的共价抑制剂为靶向RAS突变提供了一条新思路，代表性药物AMG 510、MRTX849均已经进入临床阶段。但是，KRAS G12C抑制剂的使用往往会导致肿瘤细胞通过提高其他途径形成耐受。因此，开发RAS蛋白的靶向降解也具有一定的必要性。Crews课题组尝试使用MRTX849 作为KRAS的靶向小分子，合成出系列的PROTACs，并鉴定出有作用的LC-2。LC-2能够快速、持续的降解KRAS G12C，DC50达到0.25–0.76 μM。进一步的研究发现，LC-2却不能抑制KRAS下游的通路，与MRTX849相比，抗肿瘤增殖作用也没有增强。究其原因，可能是MRTX849共价抑制剂的使用使得PROTACs的催化特性丧失。

寻找靶蛋白的新颖配体是PROTAC技术的一大核心。化学-蛋白质组学竞争实验以及DNA编码化合物库（DEL）技术分别是发现共价、非共价结合配体的有利筛选手段。其中，DEL技术目前国内成都先导药业在做，相关的技术原理可以参见其他公众号的一篇文章，此处不在赘述（点击链接）。

化学-蛋白质组学竞争实验的基本流程如图所示：将含蛋白的全细胞、细胞裂解液甚至是动物组织与待测试化合物共孵育，DMSO组作对照。结束后，再将其与带有炔基标签的泛特异性共价结合剂（例如：能够识别Cys的碘乙酰胺）作用。接着分别给样品组中Click上分子量大的标签，给对照组中Click上分子量小的标签。将两组样品1:1混合后，亲和素富集，胰酶消化，TEV断裂Biotin-AV。带有不同分子量大小标签的纯化蛋白采用质谱鉴定，具有较大轻/重比表示该蛋白与化合物发生共价结合，该蛋白是可用于共价结合的潜在靶点。轻重比为1的则表示没有化合物共价结合。使用该方案，Nomura课题组成功鉴定出Myc靶点的共价配体EN4。

（本图片来源于综述原始文献：93）

与寻找POI的小分子配体相比，实际上寻找E3泛素连接酶的配体难度更大、更具偶然性，原因主要有两个：一是对于E3连接酶的结构了解不多；二是我们找到的小分子既要能够靶向E3泛素连接酶，又不能对其活性产生影响。因此目前用的E3泛素连接酶主要还是沿用经典（例如VHL、CRBN、MDM2、clAP等），但是随着对E3泛素连接酶底物相对作用的理解加深以及筛选技术的进步，相信更多能够招募E3泛素连接酶的配体会被发现。

  上图是目前用于招募不同E3泛素连接酶的配体结构。CRBN、VHL是最常用的E3泛素连接酶。其中，沙利度胺、泊马度胺、来那度胺已经被广泛用于设计招募CRBN泛素连接酶的靶向降解。而用于招募VHL的配体早期是模拟其天然底物HIFα的肽段，后来研究人员则发现VHL的弱亲和力配体（10 μM级）也能够有效的用于靶向降解，有报道称降解活性甚至可达纳摩尔级。这一现象可能暗示E3连接酶配体与E3连接酶的高亲和力也不一定是必须的。

   泛素连接酶MDM2、cIAP、AhR已经应用在靶向降解领域多年，但是较于CRBN或VHL，目前这几种泛素连接酶使用情况并不广泛。近些年随着越来越多MDM2-p53 蛋白-蛋白相互作用抑制剂的发现，基余MDM2泛素连接酶的靶向降解也有进一步发展。值得注意的是，基于cIAP、MDM2、AhR设计的PROTACs不仅能够降解癌蛋白，还能够通过降解cIAP、上调p53等诱导凋亡，协同增加抗肿瘤细胞增殖效果。

   通过共价小分子配体招募具有泛素连接酶功能的DCAF16, RNF114, RNF4用于靶向蛋白降解也有所报道。印苦楝内酯 (nimbolide)是一种天然提取的三萜类化合物，具有防治肿瘤的药理作用。对其机制进行探寻，发现其可以与RNF114的C8结合。研究人员以nimbolide和BRD 靶点抑制剂JQ1设计的PROTACs，对BRD4的降解活性达到纳摩尔级，并且能够通过稳定p21等抑癌因子发挥类似MDM2的协同作用。尽管获得较好的实验结果，但受限于nimbolide的天然产物来源，寻找RNF114的合成替代配体是其能够广泛使用的关键。以DCAF16, RNF114, RNF4开发的PROTACs不仅扩大了可用的E3泛素连接酶种类，并且证实以共价形式结合E3泛素连接酶的PROTACs也能够具有催化特性。

PROTAC对于疾病部位与正常部位POI的不可区分性是导致其产生系统毒性的一大隐患。研究表明，人类的蛋白质组中共有不少于600种E3泛素连接酶，其中部分具有组织以及疾病特异性。在PROTAC发展的下一阶段，如果能够利用好E3泛素连接酶的分布特点，提高PROTAC降解的组织/疾病选择性，将会提高PROTAC的安全性。

一个经典的例子就是：BCL-XL是一种与BCL2相关的抗凋亡蛋白，对血小板存活至关重要。BCL-XL抑制剂navitoclax在抑制BCL-XL的同时，能够通过降解血小板BCL-XL引起剂量限制性的血小板减少，限制了其临床使用。考虑到VHL, CRBN, and cIAP 等E3泛素连接酶在血小板中表达量低，美国弗洛里达大学及MD安德森肿瘤中心的研究人员利用这几种E3连接酶，设计靶向降解BCL-XL的PROTAC，对肿瘤细胞中的BCL-XL进行选择性的降解，降低血小板毒性。更多有关E3泛素连接酶的组织特异性信息参见HμMan Protein Atlas 数据库（https://www.proteinatlas.org/）。

在过去的20年里，PROTAC虽然取得较大的进展，但是主要的发现手段却没有明显的革新：通过改变linker种类、长度、配体种类、连接位置初步设计出化合物，通过细胞实验以及Wsetern实验等判断蛋白降解活性，获得具有活性的先导化合物，再多次循环，优化活性。这种迭代优化的方法耗时耗力，如果在PROTAC下一步的发展过程中，能够借鉴小分子抑制剂设计中用到的基于结构的设计思路，则会加速PROTAC的发现过程。

 前期的研究显示，三元复合物的形成对于靶蛋白降解极为重要， 只要PROTAC与POI形成强的三元复合物并募集E3泛素连接酶，即使PROTAC弱结合POI（>1 μM）也会诱导POI降解。2017年，研究人员报道了第一例PROTAC分子MZ1与VHL、BRD4BD2形成的三元复合物结构，结果显示：MZ1引起VHL、BRD4BD2形成新的蛋白-蛋白作用（PPI）。ITC实验结果显示，MZ1介导的三元复合物形成具有正协同效应，而正协同效应与PPI的产生有关。此外，linker的存在可以通过使VHL、BRD4BD2靠近，促进PPI的形成。

过去几年，已有十余个三元复合物的结构被解析，其共同特征是出现新的PPI、柔性链的存在使POI和E3连接酶靠得很近。进一步研究发现，通过调控三元复合物的PPI，降低linker柔性，可能会影响PROTAC对POI的选择性及效力。随着更多的刚性PROTAC的发现，可以通过生物物理方法比较柔性和刚性PROTAC的结合动力学，了解刚性如何影响既定的E3连接酶/ POI三元复合物的缔合/解离。

针对PROTAC三元复合物的研究不仅为基于结构的药物设计提供思路、为揭示三元复合物形成的分子机制提供基础，也使得设计计算机程序预测PROTAC三元复合物形成成为可能。目前用以表征三元复合物形成的数学模型已经有所报道，能够在平衡状态下基于亲和力对形成三元复合物的最大浓度、缔合和解离动力学进行预测。

但由于实际降解过程并不是静态平衡的，而是一个持续流动的过程。因此为了解决上述模型无法准确描述蛋白质快速周转、去泛素化的降解动力学问题，研究人员基于MATLAB的Sim-Biology模块开发了TPD分子的动力学校正模型。该模型能够预测PROTAC的透膜性对DC50和DMax的影响，也能够根据PROTAC对E3连接酶和POI的亲和力及三元复合物的稳定性对选择性进行预测，甚至可以对PROTACs的PK、PD特性进行预测。除此以外，用于PROTAC分子对接，并对三元复合物建模的程序开发也已经基于MOE或Rosetta平台开展中。

PROTAC发展至今已有二十年，随着蛋白质组学、测序技术、组合化学等技术的发展，PROTAC的发现标准流程也必将产生深远的变化。本文作者在文末首先对PROTAC未来的发现流程进行展望，有两点值得注意的是：1、计算机模拟应用于预测PPI的产生并筛选合适Linker的情景逐渐增多，例如：AlphaFold、ProsettaC、动力学模拟等都将用于PROTAC的前期设计。2、结构生物学技术的进步（X-Ray、冷冻电镜等）将为三原复合物的结构提供更多的理解。

此外，本文作者认为PROTAC与其他领域技术（例如免疫治疗）的整合将会改变TPD领域的格局。有研究显示，PROTAC降解POI后生成的肽能够作为抗原递呈到MHC受体，增强免疫治疗效果。此外，PROTAC与免疫检查点抑制剂的联用也表现出协同作用。

在递送方式方面，PROTACs可以借鉴ADC药物。此外，纳米技术以及前药技术也将为PROTAC的靶向递送和代谢稳定做出贡献。

除以上外，在TPD领域发展的下一个阶段中，以下几个方向也值得关注：1、基于小分子RNA模拟物设计的RNA-PROTACs用于降解RNA结合蛋白；2、利用核糖核酸酶靶向嵌合体（RIBOTACs）降解RNA；3、以DNA作为招募元件降解转录因子的TRAFTAC技术；此外，基于天然产物的共价分子胶以及能够诱导BCL6聚合并降解的小分子也应该受到足够的关注。