J Ethnopharm：蛋白质组学分析揭示黄连干姜汤修复肠道屏障机制，减轻溃疡性结肠炎

2024-01-02 如沐风科研如沐风科研发表于加利福尼亚

溃疡性结肠炎（UC）是一种伴有腹痛、腹泻和便血的慢性肠道炎症。临床应用《备急千金要方》黄连干姜汤（HGD）治疗UC。然而，HGD治疗UC的具体机制尚不清楚。我们的研究致力于证明HGD对结肠炎的治疗作用

溃疡性结肠炎（UC）是一种伴有腹痛、腹泻和便血的慢性肠道炎症。临床应用《备急千金要方》黄连干姜汤（HGD）治疗UC。然而，HGD治疗UC的具体机制尚不清楚。我们的研究致力于证明HGD对结肠炎的治疗作用，并阐明其潜在的机制。采用UPLC-MS对HGD的成分进行了鉴定。给予3%右旋糖酐硫酸钠（DSS）溶液诱导UC小鼠一周，再给予HGD处理一周。观察体重波动、疾病活动指数（DAI）、结肠长度和结肠组织病理变化，评价HGD的治疗效果。用ELISA和qPCR检测炎症状态。采用蛋白质印迹、qPCR和免疫荧光检测紧密连接蛋白的表达。进行基于串联质谱标签（TMT）的蛋白质组学和网络药理学，以筛选和预测HGD调节的潜在靶点和途径。基于UPLC-MS/MS分析，在HGD中鉴定出100种成分。处理7天后，HGD显著减轻了结肠炎相关症状，包括体重减轻、结肠缩短、DAI评分增加、组织病理学病变。HGD还降低了炎症细胞因子IL-6和IL-1β水平，增加了杯状细胞的数量，并恢复了结肠中紧密连接蛋白Occludin和Claudin-1。网络药理学研究预测，结肠炎小鼠的紧密连接和MAPK通路可能受到HGD的影响。利用基于TMT的蛋白质组学研究筛选出APOC1作为HGD治疗小鼠的关键靶点。进一步的蛋白质印迹结果显示HGD降低了APOC1、p-P38和p-JNK的表达。HGD在中剂量和高剂量下改善结肠炎小鼠的一般症状，这可能与通过抑制APOC1-JNK/P38 MAPK信号通路恢复紧密连接和肠道屏障完整性和功能有关。

广州中医药大学于洋和汪玉梅教授在Journal of Ethnopharmacology上发表题为Huanglian Ganjiang decoction alleviates ulcerative colitis by restoring gut barrier via APOC1-JNK/P38 MAPK signal pathway based on proteomic analysis论文。

实验结果

1. 用UPLC/MS-MS对HGD进行定性分析

采用UPLC/MS-MS分析法，对中药复方HGD进行化学成分鉴定。HGD正离子和负离子模式下的总离子色谱图（TIC）如图1B–C所示，HGD中的100种成分被鉴定并列在补充表1中。在负离子模式下检测到36个组分，在正离子模式下发现64个组分。每种化合物在HGD中的相对比例如图1D中的饼图所示。生物碱、苯丙素、氨基酸衍生物和酚类化合物是主要化合物，它们的比例分别为55.24%、24.76%、5.42%和5.32%。

表1 黄连肝姜汤（HFD）的成分研究

图1 应用UPLC/MS-MS对HGD进行定性分析。（A）HGD中药物的组成。（B）HGD负离子模式下的总离子色谱图。（C）HGD正离子模式下的总离子色谱图。（D）HGD成分类型的比例图。

2. HGD减轻了DSS引起的小鼠结肠炎 

DSS刺激7天后，出现了一系列结肠炎相关症状，如严重的体重减轻、腹泻、便血、结肠缩短伴病理改变、脾肿大和胸腺萎缩。上述症状在HGD治疗7天后得到改善，特别是中剂量（HGD-M）和高剂量（HGD-H）组获得了与美沙拉嗪类似的效果。HGD-M、HGD-H和美沙拉嗪显著减轻了体重减轻（P<0.0001，P<0.01，P<0.05），降低了DAI评分（P<0.01，P<0.01，<0.05），延长了结肠（P<0.05，P<0.01，P<0.001），减少了脾脏指数（P<0.01，P=0.001）和增加了胸腺指数（P<0.0001）（图2B–F）。

炎症性细胞因子风暴是结肠炎过程中常见的事件，细胞因子的波动可能影响炎症性结肠炎的进展。因此，细胞因子反映了UC进展过程中的炎症状态。我们的ELISA结果显示，与对照组相比，模型组小鼠的IL-6和IL-1β水平在模型组中明显上调（图2I–J），与IL-6和IL-11β的mRNA水平相似（图2G–H）。HGD-M和HGD-H显著降低IL-6（P<0.05）和IL-1β（P<0.05）的mRNA水平以及IL-6（P<0.01，P<0.05）和IL-2β（P<0.01）的蛋白水平。

表2 疾病活动指数(DAI)评分标准

图2 HGD减轻DSS诱导的结肠炎小鼠。（A）UC小鼠模型的建立及药物治疗。（B）小鼠体重的变化。（C）DAI得分。（D）宏观结肠和长度测量。（E）胸腺指数。（F）脾脏指数。（G）IL-6 mRNA在结肠组织中的表达。（H）IL-1β mRNA在结肠组织中的表达。（I）血清IL-6水平。（J）结肠组织中IL-1β水平。每组n=6。Low，低剂量的HGD（5g/kg）；Medium，中等剂量的HGD（10 g/kg）；High，高剂量的HGD（20 g/kg）。与对照组比较#P＜0.05、##P＜0.01、###P＜0.0001，与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，***<0.0001。

3. HGD改善了结肠组织结构，修复了结肠黏膜组织

H&E染色结果显示，模型组结肠上皮细胞和肠腺排列紊乱，隐窝形状也发生改变。大量炎性细胞浸润于结肠黏膜和黏膜下层，并伴有结肠肌层水肿。服用HGD后，这些变化得到缓解，在HGD-M、HGD-H组和美沙拉嗪组中尤为明显（图3A–B）。此外，HGD还以剂量依赖的方式恢复了结肠组织的病理变化。AB-PAS和PAS染色结果显示，与对照组相比，模型组结肠杯状细胞数量和糖蛋白含量减少，HGD治疗组和美沙拉嗪组恢复正常（图3C–F）。

表3 组织病理学评分标准

图3 HGD改善结肠组织结构，修复结肠粘膜组织。（A）结肠组织的H&E染色。图中的黑色箭头标记为隐窝消失和炎症细胞浸润的位置。（B）结肠组织H&E染色的组织学评分。（C）结肠组织PAS染色。（D）结肠组织PAS染色阳性区域的比例。（E）结肠组织的AB-PAS染色。（F）结肠组织AB-PAS染色阳性面积的比例。每组n=4。Low，低剂量的HGD（5g/kg）；Medium，中等剂量的HGD（10 g/kg）；High，高剂量的HGD（20 g/kg）。与空白组相比，##P＜0.01、###P＜0.001，与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

4. HGD恢复结肠炎小鼠的紧密连接蛋白和肠道屏障的完整性

紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1的mRNA在模型组中下调，而在中剂量和高剂量的HGD中上调（图4E–G）。免疫荧光结果显示，与对照组相比，模型组紧密连接蛋白Occludin和Claudin-1的表达显著降低（P＜0.001，P＜0.01），HGD-M、HGD-H显著增加Occludin（P＜0.05，P＜0.001）和Claudiin-1的表达（P＜0.01，图4A–D）。蛋白质印迹结果也显示出类似的趋势（图4H–J）。上述结果表明，HGD可维持紧密连接，降低肠道通透性，增强肠道屏障功能。

表4 小鼠引物序列

图4 HGD恢复了结肠炎小鼠的紧密连接蛋白和肠道屏障的完整性。（A）免疫荧光法检测Occludin在结肠中的表达。（B）免疫荧光法检测Claudin-1在结肠中的表达。（C）免疫荧光法检测Occludin阳性区域的相对密度。（D）免疫荧光中Claudin-1阳性区域的相对密度。（E）ZO-1。（F）Occludin的mRNA表达。（G）Claudin-1。（H）免疫印迹法检测Occludin和Claudin-1在结肠中的表达。每组n=4。（I）各组中Occludin的相对水平。（J）免疫印迹检测各组Claudin-1的相对水平。Low，低剂量的HGD（5g/kg）；Medium，中等剂量的HGD（10 g/kg）；High，高剂量的HGD（20 g/kg）。与对照组比较#P＜0.05、##P＜0.01、###P＜0.001，与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，***<0.0001。

5. HGD治疗结肠炎的网络药理学分析

为了分析HGD治疗UC的潜在机制，进行了网络药理学分析。利用TCMSP数据库筛选出155个受UPLC/MS-MS鉴定化合物影响的潜在靶点。利用Genecards数据库获得4800个UC疾病靶点。利用Venn图发现101个HGD和UC的共同靶点。（图5A）。Cytoscape用于构建HGD成分、HGD靶点和UC靶点之间的交互网络（图5B）。GO分析结果表明，HGD通过影响几个生物学过程、细胞成分和分子功能对UC产生治疗作用（图5D）。前三个生物学过程是脂多糖介导的信号通路、miRNA转录的积极调节和上皮细胞凋亡过程的调节，这表明肠上皮屏障的变化可能是HGD影响UC的关键过程。KEGG分析结果表明，该机制可能与丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路和紧密连接有关（图5C），基于常见分子靶点的数量和P值。先前的一些研究表明，p38 MAPK信号通路可以下调紧密连接蛋白Occludin和Claudin-1。因此，我们从屏障修复和MAPK信号通路的角度探讨了HGD抗结肠炎活性的机制。

图5 HGD治疗结肠炎的网络药理学分析。（A） HGD和UC疾病靶点中潜在靶点的交叉点。（B）HGD成分、HGD靶点和UC靶点之间的作用网络。（C）HGD与UC共同靶点的KEGG分析。（D）HGD和UC共同靶点的GO分析。

6. 基于蛋白质组学分析表明，APOC1是HGD对结肠炎小鼠的潜在调控靶点

为了进一步探索HGD修复肠道屏障的潜在机制，在对照组、模型组和HGD治疗组中启动了蛋白质组学研究。我们收集了不同表达的蛋白质（DEPs），这些蛋白质在模型组中上调，但在HGD处理组中下调，反之亦然。在基于TMT的蛋白质组学分析的数据中，290个DEPs的表达在模型组中显著升高，并且在HGD处理后显著下调。26个DEPs的表达在模型组中显著下调，同时在HGD处理组中明显逆转（图6A）。以上交叉的不同表达的蛋白质（DEP）列于补充表2中。

经过生物信息学富集分析，DEP主要富集在葡聚糖代谢过程、能量储备代谢过程等多种生物过程中，以及IL-17信号通路、中性粒细胞胞外陷阱形成和糖酵解/糖异生等多种信号通路中（图6B-C）。其中，APOC1在模型组中显著上调（P<0.01），在HGD组中明显下调（P<0.01，图6D–E），引起了我们的注意。据报道，APOC1与MAPK信号通路和肠道炎症反应密切相关。因此，APOC1被筛选为HGD改善结肠炎小鼠的潜在靶点。

图6 基于蛋白质组学分析表明，APOC1是HGD针对结肠炎小鼠调节的潜在靶点。（A）DEP在模型组中上调，但在HGD组中下调，与模型组相反。（B）共同DEP的生物过程富集分析。（C）共同DEP的KEGG富集分析。（D）共同DEP的热图。（E）APOC1在小鼠结肠中的蛋白质组学表达。n＝3。HGD，黄连干姜汤治疗组。与对照组比较##P<0.01，与模型组比较**P<0.01。

7. HGD通过抑制APOC1-JNK/ P38 MAPK信号通路恢复肠道屏障

结合网络药理学和蛋白质组学的结果，我们认为HGD通过影响APOC1-JNK/P38MAPK信号通路来改善肠道屏障和减轻结肠炎的机制。为了验证这一假设，使用蛋白质印迹检测APOC1和相关下游分子在MAPK信号通路中的表达。与对照组相比，模型组p-p38-MAPK（p<0.01）、p-JNK（p<0.05）和APOC1（p<0.05）均显著升高，Occludin（p<0.01）和Claudin-1（p<0.001）降低。HGD治疗后，P-P38-MAPK（P<0.01）、P-JNK（P<0.05）和APOC1（P<0.05）显著降低，Occludin（P<0.01）和Claudin-1（P<0.01）增加（图7A–F），表明HGD抑制APOC1和下游MAPK信号，紧密连接通路。总之，HGD可能通过抑制APOC1-JNK/P38MAPK信号通路来增强紧密连接并恢复肠道屏障功能。

图7 HGD通过抑制APOC1/P38MAPK信号通路恢复肠道屏障。（A）免疫印迹法检测APOC1、p-JNK、JNK、p-P38、P38、Occludin和Claudin-1在结肠中的表达。（B）APOC1。（C）p-P38。（D）p-JNK的统计分析。（E）Occludin的统计分析。（F） Claudin-1的统计分析。每组n=4。HGD、黄连干姜汤治疗组。与对照组比较#P＜0.05、##P＜0.01、###P＜0.001，与模型组比较*P<0.05、**P<0.01。

讨论

UC作为一种慢性肠道疾病，由于反复发作，降低了患者的日常生活质量，增加了社会负担。UC的临床表现为腹泻、粪便带血和粘液、腹痛以及关节损伤和皮肤黏膜病变等几种并发症。HGD在临床上已用于治疗腹痛、腹泻，唐《备急千金要方》有记载。现代药理学研究发现，HGD减轻了结肠炎相关症状并减轻了炎症。

化学成分分析是中药药理作用和机制作用的基础，因此采用UPLC-MS/MS对HGD的化学性质进行了分析。结果表明，HGD的主要成分类型为生物碱、苯丙素和酚类。此外，HGD的主要化合物为6-姜烯酚、黄连素、表小甓碱，3-羟基苯甲酸和没食子酸。据报道，6-姜烯酚通过减少促炎细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β，增强抗氧化因子Nrf-2和HO-1的表达，减轻结肠炎并加速结肠炎伤口修复。黄连素可以通过恢复肠道屏障、减少肠道神经胶质细胞的驻留和免疫细胞的过度激活来改善UC的严重程度。没食子酸可以调节代谢和细菌特征，包括恢复肠道微生物群稳态，增加碳水化合物代谢和胆汁酸代谢，降低氨基酸代谢，从而改善溃疡性结肠炎。因此，6-姜烯酚、黄连素和没食子酸可能是HGD改善结肠炎的主要物质基础。

图8 HGD预防结肠炎机制的示意图。HGD可抑制APOC1-JNK/P38MAPK通路，恢复紧密连接，从而保护肠道屏障功能，改善结肠炎。

为了评价HGD的治疗效果，用3%DSS建立小鼠结肠炎模型，持续7天，并用HGD治疗。我们的研究发现，HGD可以减轻体重减轻，增加DAI，胸腺萎缩，脾肿大，缩短结肠。HGD还降低了结肠炎症状态，包括炎症细胞因子IL-6和IL-1β的下降。以上结果表明，HGD可以缓解结肠炎相关症状。

肠道屏障是抵御细菌、病毒等外部致病菌的第一道防线。当肠道屏障受损时，肠道通透性增加，导致微生物群从肠道内腔泄漏到肠道固有层。侵袭性致病抗原诱导炎症反应，并进一步破坏结肠屏障，形成恶性循环。我们的结果表明，HGD修复了受损的结肠组织，并恢复了紧密连接。具体而言，通过H&E、PAS、AB-PAS染色，HGD改善了结肠腺和绒毛的排列，减少了炎症细胞在固有层中的浸入，恢复了杯状细胞的结构和数量。此外，HGD通过免疫荧光和蛋白质印迹增强结肠紧密连接蛋白Occludin和Claudin-1的表达。

为了研究HGD在修复紧密连接和肠道屏障中的潜在机制，基于UC和UPLC/MS-MS从HGD中鉴定的成分之间的共同靶点进行了网络药理学分析。KEGG富集结果表明，MAPK信号通路和紧密连接可能主要与HGD的抗结肠炎作用有关。MAPK通路由细胞外信号调节激酶（ERK）1/2、c-Jun N末端激酶（JNK）、P38 MAPK（P38）组成，被细胞外信号如生长和分化因子激活。P38 MAPK（P38丝裂原活化蛋白激酶）信号通路参与炎症、细胞凋亡和细胞分化。JNKs（c-Jun N-末端激酶）也是MAPKs的一员，根据现有研究，MAPKs也参与UC的进展。P38 MAPK抑制剂降低了LPS诱导的紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-1表达的抑制作用。此外，JNK的敲除保护上皮屏障功能免受损伤。因此，P38MAPK和JNK参与了肠道屏障完整性的负调控，并参与了UC的发病机制。JNK/P38MAPK紧密连接信号通路可能介导结肠炎小鼠HGD的屏障保护。

蛋白质组学将有助于确认靶向治疗。进一步进行蛋白质组学研究，以探索HGD影响的MAPK紧密连接信号的上游分子靶点。基于TMT的定量蛋白质组学筛选了HGD治疗结肠炎小鼠和恢复肠上皮屏障的优选靶点。在不同表达的蛋白质中，APOC1在模型组明显升高，而在HGD组明显降低，表明APOC1可能是HGD介导的靶点。

载脂蛋白C1（APOC1）是参与脂质转运和代谢的一种载脂蛋白。根据目前的研究，APOC1可能与多种癌症进展有关，并作为评估癌症患者预后的生物标志物。先前的研究发现，在APOC1^+/+小鼠中，发生了一些结肠炎相关事件。例如，结肠的宏观和组织病理学异常改变，血清IL-10水平降低，而炎性细胞因子IL-12p40、IL-6和TNF-α增加。全基因组基因分析发现，一些与肠道屏障和宿主防御相关的基因，如抗微生物肽，被下调。这些发现表明APOC1与结肠炎的进展有关。此外，Ren等人发现敲低APOC1降低了大肠癌癌症细胞中p38的磷酸化，而不影响总p38，这表明APOC1与MAPK信号通路呈正相关。APOC1还被报道通过调节JNK/MAPK途径加速癌症的进展。我们的研究指出，HGD显著降低APOC1的表达，并下调P38 MAPK和JNK信号通路的磷酸化。Occludin和Claudin-1的表达水平也通过给予HGD而逆转。这些结果表明，HGD通过抑制APOC1-JNK/P38 MAPK途径恢复了肠道屏障稳态（图8）。本研究不仅证实了中药复方治疗结肠炎的安全性和有效性，而且为临床应用生长激素治疗结肠炎提供了科学依据。

结论

总之，HGD减轻了DSS诱导的结肠炎相关症状，并在中剂量和高剂量下恢复了肠道屏障稳态。HGD的潜在机制可能是抑制APOC1-JNK/P38MAPK通路。特别是，HGD抑制APOC1和JNK/P38MAPK的下游磷酸化，维持紧密连接的完整性，从而保护肠道屏障功能和完整性。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.jep.2023.116994

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2024-01-02 梅斯管理员来自加利福尼亚

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