四川大学高祥团队《ACS Nano》：肿瘤微环境活化纳米颗粒介导免疫基因治疗及M2巨噬细胞靶向抑制剂协同肿瘤免疫治疗

免疫疗法近年来在恶性肿瘤治疗领域展现了突破性的临床进展，已成为抗肿瘤的重要策略之一。肿瘤微环境（TME）是复杂的免疫抑制性环境，将免疫微环境从“冷肿瘤”重塑为“热肿瘤”对于提高肿瘤免疫治疗的疗效具有重要意义。目前已经开发了多种靶向TME的免疫治疗药物，然而由于多种免疫抑制信号的综合作用，单一的治疗方式难以发挥持续有效抗肿瘤作用，TME的异质性也限制了肿瘤免疫治疗策略的准确性和有效性。因此，需要开发多方面的方法来诱导更强大的抗肿瘤免疫反应，例如T细胞增强和巨噬细胞重编程的组合疗法以对抗癌症。四川大学华西医院高祥研究员团队在《ACS Nano》杂志在线发表了题为“Tumor-Microenvironment-Activatable Nanoparticle Mediating Immunogene Therapy and M2 Macrophage-Targeted Inhibitor for Synergistic Cancer Immunotherapy”的工作，该研究设计了一种肿瘤微环境智能响应纳米颗粒介导免疫基因治疗及M2巨噬细胞靶向抑制剂协同肿瘤免疫治疗。

免疫细胞因子作为TME细胞通讯的关键介质，可以显著激活T细胞活性。白细胞介素12（IL-12）可直接刺激自然杀伤细胞（NK）和T细胞的增殖和细胞毒性，促进1型辅助性T细胞（Th1）的分化和树突状细胞的成熟，以及间接增加细胞毒性细胞因子的产生，被认为是最有效的抗肿瘤细胞因子之一。巨噬细胞重编程或耗竭的策略在癌症免疫治疗中具有巨大的潜力，TME中的集落刺激因子-1（CSF-1）可促进免疫抑制性M2表型巨噬细胞的募集和分化，促进肿瘤进展和转移。Pexidartinib（PLX3397，PLX）是一种口服有效的CSF-1R酪氨酸激酶抑制剂，可阻止CSF-1R激酶结构域与CSF-1和三磷酸腺苷结合，减少肿瘤相关巨噬细胞（TAM）和髓源性抑制细胞（MDSC）的浸润，增加肿瘤中CD8⁺ T淋巴细胞的浸润，延缓肿瘤生长，已于2009年被美国FDA批准用于治疗无法手术的腱鞘巨细胞瘤患者。纳米医学为基因药物和小分子抑制剂疗法的联合免疫疗法设计提供了更多机会，功能化纳米系统可被TME中的酸性、强还原性、缺氧和其他特定条件激活，从而能够靶向和受控地在肿瘤部位释放载荷，增强免疫治疗药物的疗效并降低全身毒性。

针对TME的异质性限制了肿瘤免疫治疗策略有效性的挑战，高祥团队提出了一种TME响应性靶向纳米颗粒，通过共同递送表达IL-12的基因和CSF-1R抑制剂PLX3397（PLX）来增强抗肿瘤免疫和逆转免疫逃逸。二硫键引入和cRGD肽修饰使纳米颗粒兼具还原反应性和肿瘤靶向性，该系统成功递送pIL-12基因并在肿瘤局部表达IL-12激活淋巴细胞介导的宿主免疫，同时递送PLX阻断CSF-1/CSF-1R信号传导调节TAM功能，构成一种新型癌症组合免疫治疗。该功能纳米颗粒通过刺激T淋巴细胞的增殖和活化，调节TAM的极化，减少髓源性抑制细胞（MDSCs），促进树突状细胞（DC）的成熟以及抗肿瘤细胞因子的分泌，显著地改善了TME，从而有效地抑制了肿瘤的生长和转移。研究还通过单细胞分析解析了TME中不同细胞的浸润、转录状态、分泌信号传导和细胞间通讯的变化。

研究首先分别合成并表征了各纳米聚合物，通过计算机模拟研究了cRGD-PEG-PLA、PEG-SS-PLA、PLX和DOTAP在正常环境和高GSH环境下不同时间点分子动力学相互作用。然后合成和检测了pIL-12+PLX@cR-PssPD的粒径尺寸和zeta电位及电镜形貌特征。通过研究该纳米粒在不同浓度GSH的粒径尺寸变化，证实了其还原响应性。此外凝胶电泳实验和体外质粒荧光示踪分析表明该纳米粒可以包裹基因并递送其到细胞内成功表达IL-12（图1）。

图1 pIL-12+PLX@cR-PssPD的制备与表征

采用转染肿瘤细胞上清液刺激淋巴细胞后MTT法分析发现pIL-12+PLX@cR-PssPD组的增殖刺激作用最显著，进一步通过Western blot检测到淋巴细胞中磷酸化AKT和ERK的表达水平升高，提示AKT和ERK1/2相关通路激活促进淋巴细胞增殖。流式发现转染肿瘤细胞与淋巴细胞共培养后，CD4⁺CD69⁺细胞亚群和CD8⁺CD69⁺细胞亚群（细胞毒性T细胞）的比例显著增加，证实了IL-12的表达可以激活T淋巴细胞并刺激免疫反应，并且发现CD4⁺IFN-γ⁺和CD8⁺IFN-γ⁺细胞比例增加。在显微镜观察下活化的免疫细胞被围攻并攻击肿瘤细胞，导致肿瘤细胞死亡。此外在淋巴细胞的上清液中发现IFN-γ和TNF-α的分泌增加（图2）。

图2 pIL-12+PLX@cR-PssPD在体外诱导淋巴细胞增殖和活化。

用不同浓度的PLX的培养基分别处理小鼠的骨髓源性巨噬细胞（BMDM），结果表明PLX在较高剂量范围内对BMDM细胞的活力具有抑制作用。Western blot分析显示，浓度大于30nM的PLX既可以显著抑制CSF-1刺激诱导的BMDM中CSF-1R的磷酸化。收集转染肿瘤细胞的上清液刺激BMDM，流式细胞术结果显示pIL-12+PLX@cR-PssPD组CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺CD206^high 亚群（M2型）巨噬细胞比例降低。Western Blot结果显示STAT6和STAT3的活化受到抑制，IRF4下调，RT-PCR结果证实了免疫抑制性M2型巨噬细胞相关基因表达减少。这些结果表明，pIL-12+PLX@cR-PssPD具有抑制巨噬细胞向M2型极化的能力，从而发挥抗肿瘤作用（图3）。

图3 pIL-12+PLX@cR-PssPD在体外重编程巨噬细胞

为了更好地探索cR-PssPD在体内的治疗效果，分别建立了B16-F10皮下黑色素瘤和CT26肿瘤腹膜转移的小鼠模型并给予相应的治疗。结果显示，pIL-12+PLX@cR-PssPD治疗后小鼠黑色素瘤皮下瘤体积和瘤重最小。在所有治疗组中，pIL-12+PLX@cR-PssPD组的腹腔肿瘤重量最低，且转移性结节和腹水量显著减少，以上共同表明pIL-12+PLX@cR-PssPD能有效抑制小鼠皮下黑色素瘤的生长和小鼠结直肠癌腹膜内转移，显示出良好的治疗效果（图4和5）。

图4 pIL-12+PLX@cR-PssPD在体内抑制黑色素瘤皮下肿瘤生长

图5 pIL-12+PLX@cR-PssPD在体内抑制CT26肿瘤腹腔转移

进一步研究了pIL-12+PLX@cR-PssPD对肿瘤免疫微环境的调控作用。发现在pIL-12 + PLX@cR-PssPD组的荷瘤小鼠肿瘤组织、腹水中IL-12，IFN-γ和TNF-α表达水平增加。流式细胞术结果发现CD45⁺CD11b⁺F480⁺CD206^high亚群和CD11b⁺CD45⁺Ly6G^intLy6C^low亚群的比例显著降低，提示巨噬细胞M2极化减少和粒型MDSC浸润比例降低。而CD11c⁺CD86⁺细胞和CD49b⁺CD107a⁺亚群的比例显著增加，表明DC细胞成熟和NK细胞活化增加。此外，还在荷瘤小鼠脾脏中CD8⁺CD69⁺细胞亚群的增加以及CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺细胞的百分比显著降低。这些结果均表明 pIL-12+PLX@cR-PssPD有效改善了免疫异抑制性TME并增强了抗肿瘤免疫潜力（图4和5）。

收集不同治疗组的小鼠肿瘤样本，获得了90,341个细胞用于后续分析。降维后分簇结果显示，IL-12组和联合治疗组中除B细胞外所有类型的免疫细胞的比例均显著增加，而肿瘤细胞比例显著降低。研究显示，CCL、CXCL、TNF和CSF在免疫微环境细胞通讯中发挥重要的调节作用，联合治疗可促进TAM M1和TAM Mx细胞的浸润和功能，可能通过增强抗肿瘤免疫和抗原提呈发挥肿瘤抑制作用（图6）。NKT细胞主要分为两个簇：NKT A可能是一种增殖前体。NKT B可能是具有直接抗肿瘤作用的成熟细胞亚群。免疫细胞调节信号MHC1和PD-L1是髓系细胞影响NKT细胞的途径。髓系细胞主要产生信号，NKT A接收MHC-1信号和PD-L1信号(图7)。研究发现联合治疗降低了增殖肿瘤的细胞比例，但增加了表达MHC I基因的肿瘤细胞比例，可能与逆转肿瘤细胞的免疫逃逸有关。联合组的整体分泌因子信号强度高于GS组，免疫细胞之间的信号交流加强，NKT细胞与免疫细胞(髓系细胞和NKT)和肿瘤细胞之间的连接明显增强（图8）。

图6 联合免疫治疗后髓系细胞的转录组学分析

图7 联合免疫治疗后NKT细胞的转录组学分析

图8 联合免疫治疗后肿瘤细胞的转录组学分析

【小结】

本研究介绍了一种新型肿瘤微环境智能响应系统pIL-12+PLX@cR-PssPD，该纳米粒具有主动肿瘤靶向能力、TME智能响应性、优异的抗肿瘤疗效以及低全身毒性等优点。通过与整合素αvβ3结合到达肿瘤部位后，纳米结构中的二硫键在GSH的作用下被破坏，结构崩解导致药物和基因释放。IL-12的成功表达和CSF-1R的抑制有效改善了TME，增强抗肿瘤免疫和解除免疫抑制，从而阻止了肿瘤的生长和转移，该研究为恶性肿瘤免疫治疗提供了新策略。四川大学华西医院高祥研究员为该论文的独立通讯作者，该研究受到国家自然科学基金、四川大学华西医院1⋅3⋅5工程学科发展基金的等项目资助。

原文链接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.3c10037