IVD新技术丨基因工程猪肾脏移植中的分子检测

我们离基因工程猪肾脏移植技术实现还有多远？这中间还有多长的路要走？本文介绍其中可能涉及的分子检测，对于做检测的我们早日布局，挖掘探索。

异种移植有机会解决全球器官短缺问题，但在临床应用之前，必须将人工改造的猪供体器官在非人类灵长类动物 (NHP) 模型中进行测试以确保其安全性和有效性。2023年10月11日Nature杂志上合作发表了一篇题为Design and testing of a humanized porcine donor for xenotransplantation 的文章，来自eGenesis的Wenning Qin和Michele E. Youd团队对尤卡坦半岛小型猪供体进行69次基因编辑，实现3种糖类抗原的消除、猪内源性逆转录病毒失活和7个人类转基因过表达，将供体猪肾移植到NHP体内并与临床相关免疫抑制方案相结合，可支持NHP长期存活达758天。这一研究成果离基因工程猪肾脏移植的临床试验更近了一步。

01 异种移植 

• 异种移植是将动物来源的活细胞、组织、器官以及体液移植入或输注到人类受体中。异种移植的最大难题是免疫排斥，需要通过基因编辑技术来改造供体动物，使其表达人类兼容的抗原或抑制因子。

• 基因编辑技术可以分为敲除和转入两类。敲除技术是将供体动物的某些基因关闭或删除，以减少其与人类受体的免疫冲突。转入技术是将人类的某些基因导入供体动物，以增加其与人类受体的免疫相容性。

目前，已知的异种移植涉及的分子产品主要有以下几类：

1. 异种抗原：这些是供体动物表面存在的一些糖基化或蛋白质结构，可以被人类受体识别为外来物质，引发免疫反应。常见的异种抗原有 α-1,3-半乳糖基转移酶（GGTA1）、胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶（CMAH）和 β1,4N-乙酰半乳糖胺基转移酶（βGalNT2）等。

2. 补体抑制因子：这些是可以阻断补体系统激活的一些蛋白质，从而减轻超急性排斥反应。常见的补体抑制因子有 CD46、CD55和 CD59等。

3. 凝血调节因子：这些是可以调节凝血过程的一些蛋白质，从而防止血栓形成和出血并发症。常见的凝血调节因子有血栓调节蛋白（TBM）、内皮细胞蛋白 C受体（EPCR）和组织因子通路抑制剂（TFPI）等。

4. 抗炎症细胞因子：这些是可以抑制炎症反应的一些蛋白质，从而降低急性和慢性排斥反应。常见的抗炎症细胞因子有 CD47、血红素加氧酶-1（HO-1）和白介素-10（IL-10）等。

02 相关问题

• 免疫排斥反应：这是异种移植最大的难题，由于动物与人类的免疫系统存在巨大的差异，人类受体会对动物供体产生强烈的免疫反应，导致移植器官功能紊乱或衰竭。虽然通过基因编辑技术可以减少部分异种抗原的表达，但仍无法完全避免排斥反应的发生。

• 生物安全风险：这是异种移植最危险的隐患，由于动物身上可能携带一些未知的病毒或微生物，如果通过异种移植传播到人类，可能会引发严重的传染病或公共卫生危机。其中最令人担忧的是猪内源性逆转录病毒（PERV），这是一种整合在猪基因组中的反转录病毒，可以感染人类细胞，并可能导致癌症或免疫缺陷。

• 跨种系适配问题：这是异种移植的技术难点，由于动物与人类的生理功能存在一定的差异，即使动物器官在大小和结构上与人类相似，也不一定能够在人体内正常工作。例如，猪心脏与人心脏在激素分泌、代谢平衡、凝血调节等方面有不同的机制，这些差异可能会影响异种移植心脏在受体体内的长期存活。

• 社会伦理问题：这是异种移植的道德难题，由于动物与人类在进化和文化上有很大的距离，将动物器官移植到人类可能会引发一些伦理和法律上的争议。例如，是否尊重动物的生命权利和福利？是否影响人类的尊严和身份认同？是否违反自然法则和宗教信仰？这些问题都需要在严格的伦理框架下进行审慎考量。

03 免疫排斥检测

免疫排斥反应是异种移植最大的难题，也是评估效果的关键指标。免疫排斥反应可以分为超急性、急性和慢性三种类型，分别发生在移植后的几分钟、几天和几周或几月。

• 实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）：这是一种可以检测特定基因或转录本的表达水平的技术，可以用来评估受体细胞中的免疫相关基因或因子的活化情况。例如，可以通过 RT-qPCR 检测受体细胞中的细胞因子、趋化因子、白细胞介素受体、肿瘤坏死因子等基因或转录本的表达水平，以反映免疫排斥反应的程度 。

• 蛋白质组学分析（Proteomics）：这是一种可以检测特定蛋白质或多肽的表达水平或修饰状态的技术，可以用来评估受体细胞中的免疫相关蛋白质或因子的活化情况。例如，可以通过蛋白质组学分析检测受体细胞中的细胞因子、趋化因子、白细胞介素受体、肿瘤坏死因子等蛋白质或多肽的表达水平或修饰状态，以反映免疫排斥反应的程度。

• 微阵列芯片（Microarray）：这是一种可以同时检测多个基因或转录本的表达水平的技术，可以用来评估受体细胞中的免疫相关信号通路或网络的活化情况。例如，可以通过微阵列芯片检测受体细胞中与 T 细胞活化、B 细胞活化、自然杀伤细胞活化、巨噬细胞活化等相关的基因或转录本的表达水平，以反映免疫排斥反应的程度。

04 免疫排斥反应检测试剂

• 使用实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）方法设计一款免疫排斥反应检测试剂

1. 选择合适的靶标：靶标是指可以反映免疫排斥反应程度的 DNA 或 RNA 序列，例如细胞因子、趋化因子、白细胞介素受体、肿瘤坏死因子等基因或转录本。选择靶标时，需要考虑其特异性、敏感性、稳定性和可检测性等因素。

2. 选择合适的荧光化学试剂：荧光化学试剂是指可以与 PCR 产物特异性结合或掺入的荧光基团，例如荧光染料或荧光探针。选择荧光化学试剂时，需要考虑其灵敏度、特异性、动态范围和成本等因素。

3. 选择合适的内参：内参是指可以作为正常化因子的 DNA 或 RNA 序列，例如 GAPDH、β-actin 等基因或转录本。选择内参时，需要考虑其与靶标在表达水平、稳定性和可变性等方面的相似性。

4. 选择合适的定量方法：定量方法是指可以根据荧光信号强度计算靶标起始拷贝数的方法，例如绝对定量法或相对定量法。选择定量方法时，需要考虑其准确性、可重复性和可比较性等因素。

05 跨种系适配

• 跨种系适配问题是指动物与人类的生理功能存在一定的差异，即使动物器官在大小和结构上与人类相似，也不一定能够在人体内正常工作。跨种系适配问题是异种移植的技术难点，也是评估效果的重要指标。

• 运用分子生物学手段解决跨种系适配问题

1. 选择合适的供体动物：供体动物是指可以提供活细胞、组织、器官或体液的动物，例如猪、牛、羊、猴等。选择供体动物时，需要考虑其与人类在进化、解剖、生理、免疫等方面的相似性和差异性。

2. 选择合适的基因编辑技术：基因编辑技术是指可以对供体动物的基因组进行精确的增加、删除或替换的技术，例如 CRISPR/Cas9、TALEN、ZFN 等。选择基因编辑技术时，需要考虑其在效率、精确性、安全性和成本等方面的优劣。

3. 选择合适的编辑靶点：编辑靶点是指可以影响供体动物与人类受体之间的生理功能匹配度的基因或位点，例如血型抗原、凝血因子、激素受体等。选择编辑靶点时，需要考虑其在功能重要性、表达水平和可变性等方面的影响。

4. 选择合适的评价方法：评价方法是指可以用来检测或验证基因编辑技术对供体动物生理功能的改善效果的方法，例如 PCR、Southern blot、Western blot、免疫组化等。选择评价方法时，需要考虑其在灵敏度、特异性、准确性和效率等方面的适用性。