蔡真教授：多发性骨髓瘤中硼替佐米耐药的秘密
2017-12-18 佚名 ioncology
蛋白酶体抑制剂硼替佐米是治疗多发性骨髓瘤（MM）最有效的药物之一。然而，在长期硼替佐米治疗期间，MM细胞可能最终产生对硼替佐米的获得性耐药，导致复发和不良预后。探索硼替佐米的耐药性机制及其攻克手段是业内人士一直以来孜孜以求的目标之一。
蛋白酶体抑制剂硼替佐米是治疗多发性骨髓瘤（MM）最有效的药物之一。然而，在长期硼替佐米治疗期间，MM细胞可能最终产生对硼替佐米的获得性耐药，导致复发和不良预后。探索硼替佐米的耐药性机制及其攻克手段是业内人士一直以来孜孜以求的目标之一。
NEDD4-1 Modulates the Resistance of Multiple Myeloma to Bortezomib Via PTEN/PI3K/Akt Signaling Pathway
摘要1787 NEDD4-1通过PTEN/PI3K/Akt 通路介导硼替佐米在多发性骨髓瘤中的耐药
背景：多发性骨髓瘤（MM）是第二常见的恶性血液肿瘤，蛋白酶体抑制剂硼替佐米（Bor）是治疗MM最有效的药物之一。然而，在长期硼替佐米治疗期间，MM细胞可能最终产生对Bor的获得性耐药，导致复发和不良预后。有研究表明，主要决定泛素蛋白酶体系统的底物特异性的E3泛素连接酶（E3s）对硼替佐米的耐药性起着重要作用。NEDD4-1 E3s是神经前体细胞表达的发育调控基因4（NEDD4）的家族成员，被证明参与癌细胞的增殖、迁移、侵袭过程，并与抗癌治疗的敏感性相关。该研究旨在探讨NEDD4-1在MM获得性Bor耐药中的作用及其机制。
方法：通过半定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）和Western印迹测定患者MM细胞系（NCI-H929，ARP-1，RPMI8226，OPM2，CAG，MM.1S）和MM细胞（骨髓的CD138 +浆细胞）中NEDD4-1及其底物的水平。将含有靶向NEDD4-1的shRNA慢病毒质粒转染到MM细胞中。NEDD4-1通过慢病毒载体介导的NEDD4-1-cDNA转染在MM细胞中过表达。通过细胞计数试剂盒8（CCK8）和流式细胞术测量MM细胞的细胞活力、增殖和凋亡。为了测定免疫沉淀内源性蛋白质，将全细胞提取物与靶向NEDD4-1、PTEN、PI3K或Akt的抗体以及IgG对照一起免疫沉淀。使用公开可用的基因表达谱（Oncomine）数据集评估MM中NEDD4-1表达的临床意义。
结果：Oncomine结果显示，来自单克隆免疫球蛋白病（MGUS）和MM患者的MM细胞的NEDD4-1表达水平高于浆细胞白血病患者。复发患者的NEDD4-1表达低于初诊患者。此外，MM细胞系NCI-H929、ARP-1和RPMI8226在mRNA和蛋白质水平高度表达NEDD4-1。CAG和OPM2的表达相对较低。细胞生长分析显示NEDD4-1敲除（KD）与对照组之间的增殖无显着差异（P> 0.05）。抑制NEDD4-1表达后，硼替佐米对MM细胞的杀伤力显着减弱（P <0.05），MM细胞周期停滞在G2 / M期（P <0.05），而NEDD4-1过表达（P <0.05）后可以使MM细胞对Bor敏感（P <0.05）。在回补实验中，在NEDD4-1 敲除细胞中过表达NEDD4-1可以使MM细胞重新对Bor敏感。在NEDD4-1 敲除细胞中，Bor处理后显着激活Bcl-2、CDK4和CDK6的表达，而cleaved -capase-3、PARP-1、P21和P27则被抑制；而NEDD4-1过表达细胞的结果则相反。与对照组相比，NEDD4-1敲除促进PI3K、pAkt（Ser473）的活化，但PTEN的表达显着降低。另一方面，NEDD4-1过表达使PTEN / PI3K / Akt途径失活。此外，我们在NEDD4-1免疫沉淀物中检测到PTEN、PI3K和Akt，但在IgG对照中没有。相反，在Akt免疫沉淀物中可检测到NEDD4-1、PI3K和PTEN。
结论：NEDD4-1可通过抑制PTEN / PI3K / Akt信号通路促进MM对硼替佐米的敏感性，还可以与PTEN / PI3K / Akt相互作用形成复合物。这些结果表明，NEDD4-1可作为治疗MM的新型药物靶标。
点评：
目前，在新药时代，针对多发性骨髓瘤患者的治疗以选择蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂为基础的联合方案为主，大会上特别提到了硼替佐米为基础的联合方案的总体有效率达到80%-90%。随着硼替佐米在临床上特别是多发性骨髓瘤或者其他领域的广泛应用以及给药时间的延长，部分患者伴有原发耐药，或者在应用药物治疗的过程中间出现继发性耐药，主要与多发性骨髓瘤的基因改变有关，或者说是由于基因克隆的演变而导致耐药。
目前有关硼替佐米耐药机制研究的相关报道证实：硼替佐米耐药机制可能主要与细胞内多药耐药多糖蛋白表达的增高以及药物对细胞内泵产生影响，同时可能还伴有细胞内的基因改变从而导致了硼替佐米的结合度下降。关于蛋白酶体抑制剂硼替佐米在整个蛋白质降解的过程中泛素化途径或表达的异常，最终导致了多发性骨髓瘤对蛋白酶体抑制剂硼替佐米产生耐药。
针对蛋白酶体抑制剂硼替佐米泛素化的研究，真核生物体蛋白质的降解主要是通过蛋白酶体的途径，很多具有生物和生理功能的蛋白底物在泛素激活酶、泛素结合酶以及泛素连接酶的共同酶促级联反应过程中结合蛋白酶体，最终导致了蛋白质的降解，这个过程中蛋白酶体的结构发生了改变，影响了硼替佐米整体对底物的影响。
在2017年ASH年会上一研究壁报数据显示：E3连接酶是连接蛋白酶体抑制剂以及底物的关键酶，E3连接酶有很多亚类，该研究对NEDD4-1的E3连接酶展开了研究，发现如果NEDD4-1表达增高，或者说敲除NEDD4-1后都可能对硼替佐米的敏感性发生改变，同时信号通路也发生了非常大的改变，特别是PTEN/PI3K/Akt通路都有明显的变化，引起硼替佐米对药物的敏感性产生改变。目前主要注重其底物的影响和底物结构功能改变研究，初步研究发现AKT是其底物之一，未来还会开展进一步的深入研究。
注：研究内容选自ASH大会上一项关于探索E3泛素连接酶NEDD4-1在硼替佐米MM获得性耐药中作用及其机制的研究的口头报告
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