张锋：利用CRISPR发现未知基因功能

基因编辑，尤其是CRISPR/Cas9系统，从某种意义上来说就像是一辆正在生产的闪亮新车，在构建主要框架的同时也开始启动，而且还准备开始一路飚车。

自2012年底CRISPR/Cas9最初被用于基因编辑之后，这个前途光明的技术已经被应用到了许多研究领域，而且随着技术的改良，越来越多的研究团队利用CRISPR进行大规模的遗传筛选，比如用于识别导致癌症抵抗治疗的突变，或者加速药物靶标评估。RNA干扰，相比于CRISPR/Cas9 在遗传筛选方面的作用，无论是效率和特异性方面，目前都难以望其项背了。

同时，譬如MD安德森癌症中心等处的研究人员也开始进一步了解CRISPR/Cas9的特性和局限性，了解它到底能做些什么，比如分析人类细胞系。CRISPR/Cas9 工具箱不断的扩大，Broad研究院的张锋等人也开始利用Cas9结合到基因组上，停止或者加强转录。他们对于CRISPR/Cas9在遗传筛选方面的作用，有何看法呢？

张锋研究组曾在“Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity”这篇文章中，探讨了从化脓性链球菌中改变了组成Cas9酶的1400个氨基酸中的3个氨基酸，从而将基因编辑中脱靶效应降低到了几乎无法检测的水平的可能性。当RNA 与DNA 不是那么配对的时候，Cas9内切酶会诱导脱靶突变，导致这无法成为临床试验中的精确基因编辑。

为了能容纳下Cas9蛋白，DNA链需要分开，张锋研究组进行了结构分析，发现在Cas9蛋白位点的负电荷非靶标DNA上有一个合适的正电荷凹槽。“我们认为如果能中和部分正电荷，就能消弱稳定性，从而能Cas9更具特异性，”张锋说。

他们利用已知定位在特殊脱靶位点上的导向RNAs来进行了这个方法的实验，研究组构建出了Cas9的32个单突变，然后将每个突变通过EMX1基因有效，但容易出现错误的导向RNA，靶向EMX1。

结果发现其中五个能完成EMX1基因的基因编辑，但是会十倍比率的减少脱靶位点的切割，之后研究人员又尝试利用Cas9突变去切断另外一个基因：VEGFA，这种基因已知能在两个之前识别的脱靶位点上进行切割。虽然所有的Cas9突变都减少了脱靶效应，但是研究人员认为他们应该结合这些突变，让Cas9更加特异性。因此他们利用三点突变体（triple-point mutations）产生了两个不同的突变，发现“我们能完成靶向激活，并进一步减少脱靶活性，”张锋说。

如何利用CRISPR发现未知基因功能

CRISPR 系统的一大亮点在于导向RNAs的特异性，张锋说，这样一来我们就能生成靶向每个基因或某个基因多个位点的CRISPR导向慢病毒库。然后再转导进入细胞系，获得单个基因或被激活，或被失活的细胞池。

2014年，2015年张锋研究组陆续发表了相关的不少文章，如其研究组曾构建了靶向18,080个基因（64,751个独特靶向序列）的全基因组范围CRISPR-Cas9敲除（GeCKO）文库慢病毒库，用于进行在人类细胞中的正向和负向选择性筛选。之后这个研究组还建立了70,290个导向RNA的文库，来靶标人类基因组超过两万个基因，由此鉴定出了让黑色素瘤抵抗药物PLX-4720的基因。PLX-4720对于携带BRAF突变的患者疗效比较好，残存下来的癌细胞会长成新的肿瘤，导致癌症复发。

BRAF V600E 是一个著名的致癌突变，美国FDA曾批准的抗癌药Zelboraf（vemurafenib，罗氏）就是靶向这个突变，但是随着细胞快速突变，一些患者在第24周治疗时出现了抗性，肿瘤复发。

“这也许是一个机会，我们可以利用全基因组文库检测哪些基因在打开或者关闭的时候，导致肿瘤细胞对vemurafenib产生了抗性，”张锋说。

这种CRISPR 基因敲除文库采用了能靶向基因组中所有保守编码外显子的导向指引，“在设计这些多条件筛选实验的时候，我们用的都是多个导向，因此出现了一些冗余，同时也能告诉了我们，任何单个导向的效率并不是由于脱靶修饰，”他补充道。研究组也尝试验证了他们的这些新候选，将研究结果与之前的RNAi筛选进行比对，结果发现能找到几个vemurafenib抗性的top hits，而RNAi筛选只能找到一个。

张锋研究组研发的功能获得突变 CRISPR 筛选系统也能帮助完成了vemurafenib抗性研究，他将这个新型CRISPR激活基因筛选工具称为SAM，也就是协同激活调控子（synergistic activation mediator，生物通译），利用这一系统，其研究组激活了12个不同的基因，这些基因如果采用之前的方法很难进行开启，“而且之前系统中许多基因实际上都无法真正激活，这一新系统能百倍，或者千倍的激活转录，”张锋说。

张锋实验室目前尝试通过识别基因编辑更多有用的酶，进一步扩增 CRISPR 编辑工具箱。比如去年秋天他们发现了Cpf1，这是具有不同剪切活性的DNA内切酶，能用于某些情况。新Cpf1系统也具有一些不同于Cas9的地方：

1.在它的自然形态下，DNA切割酶Cas9与两条小RNAs形成了一种复合物，两条RNAs均是获得切割活性的必要条件。Cpf1系统更简单一些，它只需要一条RNA。Cpf1酶也比标准SpCas9要小，使得它更易于传送至细胞和组织内。

2.且有可能最重要的是，Cpf1以一种不同于Cas9的方式切割DNA。当Cas9复合物切割DNA时，它切割的是同一位点的两条链，留下的“平端”（blunt ends）在重新连接时往往会发生突变。采用Cpf1复合物生成的两条链切口是偏移的，在裸露端留下了短悬端（overhang）。这预计有助于精确插入，使得研究人员能够更有效及精确地整合一段DNA。

3.Cpf1切口远离识别位点，这意味着即便在切割位点靶基因突变，仍然可以进行再度切割，提供了多次机会来校正编辑。

4.Cpf1系统为选择靶位点提供了新的灵活性。像Cas9一样，Cpf1复合物必须首选附着PAM,短序列，选择的靶点靠近自然存在的PAM序列。Cpf1系统识别的PAM序列与Cas9截然不同。这在靶向某些基因组如疟原虫及人类基因组时可能是个优势。

此外，研究组还发现了其它CRISPR/Cas系统 C2c1, C2c2 and C2c3，目前他们正在研究其作用机制。

参考文献：

Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells

Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex

A genome-scale RNA interference screen implicates NF1 loss in resistance to RAF inhibition

Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system

Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems