Commun Biol：复旦附属中山医院团队揭示原发性肝癌微环境分子特征及空间异质性

原发性肝癌（PLC）是全球癌症死亡的主要原因之一，主要包括异质性肝细胞癌（HCC）、肝内胆管细胞癌（ICC）和混合型肝细胞-胆管细胞癌（CHC）等三种类型，其在发病机制、生物学行为等方面差异较大。由于分子调控网络的复杂性以及人们对PLC与肿瘤微环境（TME）关系认识不足，阻碍了对PLC机制、药物通路和治疗反应的探究，目前亟需对PLC进行深入分析。

单细胞RNA测序（scRNA-seq）是一种在单细胞分辨率下探索癌症及其TME的有效方法，但在探索实体肿瘤的形态学分辨率方面存在局限。空间转录组学（ST）是一种高通量RNA测序技术，以spot细胞（10-200个细胞）分辨率克服了上述限制。但在表观遗传学、蛋白质组学和代谢组学方面，以上两种技术都存在不足。因此，具有大样本组织分辨率的多组学分析可能是解决这些难题的潜在方法。

近日，复旦大学附属中山医院邱双健、樊嘉、易勇、周佩云团队在Communications Biology上发表了题为“Single-cell and spatial architecture of primary liver cancer”的文章。研究团队利用scRNA-seq、空间转录组和批量多组学技术，阐述了3种PLC类型的分子架构。在高分辨率视角下，该研究发现CHC细胞表现出内部不一致的表型，而ICC和HCC表现出不同的肿瘤特异性特征。此外，研究团队还在肿瘤-肿瘤周围交界区发现了具有不同表型的中间状态内皮细胞（ECs）亚群，并分析了其空间分布模式。综上，该研究提供了对PLC微环境同质性和异质性特征的见解，有助于促进药物开发和相关病理研究。

文章发表在Communications Biology上

主要研究内容

PLC的多模态图谱分析

研究团队从7例PLC（P121-P123 ICC, P124-P125 HCC, P126- p127 CHC）患者的部分新鲜肿瘤、瘤周和外周血中分离单细胞（SC），并收集了患者术后1个月的外周血以及P126患者部分转移性淋巴结，最终对27个样本进行了scRNA和scV(D)J测序（图1）。

经质量筛选，SC数据集包括289,156个高保真测序细胞和110,013个V(D) j测序细胞。依据细胞类型对SC数据进行聚类，共得到4个主要细胞群，由25个超簇组成。其中，64,443个细胞来自HCC，86,302个来自ICC，96,770个来自CHC。研究团队在4个主要细胞群中分别进行第二次聚类，得到更精确的子簇，用于进一步分析。

图1.  PLC的分子结构。

为探索PLC的空间异质性，研究团队对来自2个供体（P128HCC、P129 ICC）的5个额外组织切片进行了ST检测（图2）。共获得21,571个ST spot，单个spot平均包含10,995 UMI和3,092个基因。根据切片的组织结构，研究团队划分了4个带注释的空间区：肿瘤（T）区、瘤周（P）区、肿瘤-瘤周交界区（J）和基质（S）区。研究团队对scRNA-seq和ST数据进行了整合，使用相互最近邻（MNN）和多模态交叉分析（MIA）将单细胞簇与其空间位置相对应，发现大多数非实质细胞和免疫细胞位于S区或J区。

为扩大PLC分子结构的边界，研究团队对15个相匹配的实质组织进行多组学分析，从不同组学的角度进行无监督聚类以探究组织水平的异质性。结果显示，表观基因组学和代谢组学呈混沌分布，mRNA、lncRNA和蛋白质组学呈组织类型相关的分布，表明mRNA、lncRNA和蛋白质组学的变化对表型影响较大。

PLC肿瘤-瘤周交界区的空间表达模式

为解析不同区域的空间表达模式，研究团队对每个ST切片进行聚类分析，并使用UMAP可视化。结果显示，肿瘤组织的簇点在空间分布上更集中，而癌旁组织的簇点更为分散，这可能由肿瘤的克隆进化模式所致。UMAP图显示，簇点呈组织相关分布，其中J区的簇点聚集在一起，距离T和P区的簇点相对较远。上述结果表明，与表型相对一致的T区和P区相比，J区表现出相对复杂的空间表达模式，提示J区在细胞发育命运中可能具有特定的功能特征。

图2. 肿瘤、肿瘤周围及肿瘤-瘤周交界区的空间模式。

PLC肿瘤内部异质性

研究团队对三种不同类型的PLC进行并行分析，第一次聚类中与恶性细胞相关的三个超簇被分别标记为M1、M2和M3（图3）。结果显示，M1、M2和M3之间存在显著异质性，其中M2的G2M或S期增殖高于M1和M3，这种异质性也存在于肿瘤间和个体水平上。在第二次聚类后，M1在UMAP中被明确地分成19个亚簇，其中9个亚簇具有患者特异性，M2和M3的亚簇也是如此；这些患者特异性亚簇主要由恶性细胞组成。

研究团队依据PLC类型对特异性亚簇进行分析，并利用ST结合scRNA-seq数据，比较了HCC和ICC的表型差异。结果显示。HCC亚簇中存在异常代谢过程的富集，ICC亚簇表现出异常氧代谢和上皮-间质转化（EMT）的富集，CHC亚簇的基因富集涉及HCC和ICC亚簇。

研究团队利用SCENIC进一步分析了不同PLC肿瘤细胞的转录模式，发现CHC亚簇显示出与HCC和ICC中不同的由转录因子（TF）调控的活性调控。这些结果表明，HCC和ICC具有不同的肿瘤特异性特征；与其他两种PLC类型相比，CHC具有内部不一致的表型特征。

图3.  PLC恶性细胞在单细胞水平上的不同表型。

癌症相关成纤维细胞具有肿瘤类型特异性特征

为研究PLC中成纤维细胞的分子特征，研究团队对超簇F重新聚类，并进行拷贝数变异（CNV）分析（图4），共得到8个亚簇（C1-C8），表现出不同的基因表达特征；亚簇中细胞的CNV比异质恶性细胞更少，表明其是癌症相关成纤维细胞（CAFs）。大多数亚簇处于活跃状态，并显示出已知功能，如血管发育、细胞外基质组织和对创伤的应答。

研究团队对来自不同肿瘤类型的CAFs分子特征进行了探索，发现ICC来源CAFs具有丰富的形态发生、骨骼发育和对生长因子应答等特征；HCC来源CAFs具有丰富的髓系白细胞活化和代谢过程特征；CHC来源的CAFs兼具上述两种特征。

研究团队还使用Monocle 2算法对CAFs进行伪时间排序。结果显示，ICC来源和HCC来源的CAFs 位于伪时间轨迹的两端，表明其在基因表达谱上存在差异；CHC来源的CAFs位于轨迹的中间，这证实其在基因表达谱中具有涉及ICC和HCC来源CAFs的双重特征。上述结果表明 ，CAFs的功能由肿瘤类型及其TME驱动。

图4. PLC中癌症相关CAFs的鉴定。

此外，研究团队还广泛分析了PLC中CAFs的单细胞分子特征，发现与其他两种类型相比，其在 ICC中更普遍；ICC中分布着较丰富的MYH11+ CAFs，这提示以CAFs为靶点的治疗策略可能在ICC治疗中更有效。

PLC肿瘤-瘤周交界区内皮细胞处于中间状态

为绘制PLC的内皮细胞（ECs）图谱，研究团队对两个与ECs相关的超簇进行重新聚类，共获得15个亚簇，包括CLEC4G+肝窦ECs（LSECs）、肿瘤相关ECs（TAECs）、中间状态ECs和其他ECs（图5）。其中，TAECs具有肿瘤异质性，LSECs和中间状态ECs在肿瘤和个体水平上均未表现出明显异质性。

接下来，研究团队使用GSVA、Scenic、伪时间轨迹和RNA velocity分析了TAECs、LSECs和中间状态ECs在分子特征上的差异。结果显示，TAECs中富集了EMT、肌生成等标志性基因，中间状态ECs显著表达富集在早期和晚期雌激素反应中的基因，LSECs未表现出明显的标志或代谢基因集富集。此外，中间状态ECs具有来自LSECs和TAECs的双重功能潜力。

研究团队分析了中间状态ECs的功能是否与其空间分布模式有关。结果显示，与T区域或P区域相比，中间状态ECs更多位于J区域，这与其中间功能状态一致。综上，该研究确定了一群中间状态ECs，其功能状态介于LESCs和TAECs之间，这可能与其在J区域的空间分布有关。

图5. 中间状态内皮细胞的鉴定。

结 语

综上所述，研究团队展示了PLC的详细情况，同时包括HCC、ICC和CHC，并涵盖了病毒特征和肿瘤大小的多样性。通过将单细胞转录组学、免疫组库、spot细胞ST和大组织多组学进行整合，为对不同类型PLC进行全面观察和平行比较提供了机会，并揭示了PLC微环境的分子特征，并提示肿瘤-肿瘤周围交界区可以作为精确治疗策略的靶向区域。

参考文献：

Zhou, PY., Zhou, C., Gan, W. et al. Single-cell and spatial architecture of primary liver cancer. Commun Biol 6, 1181 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05455-0