空间转录组学方法EEL FISH：可实现高复用、高空间通量和高分辨的原位单细胞分析

大脑是一个高度结构化的器官，包含多种细胞类型，具有复杂的空间模式组织。目前研究分析这些不同细胞类型之间的组织和空间关系仍具有挑战性。近年来，更新的空间方法可以通过测序或显微镜来检测空间中的mRNA。基于测序的方法将组织切片中的mRNA转移到表面上，然后通过测序收集和解析，但这种方法受到低捕获效率、捕获点间的差距和高测序成本的限制。基于显微镜的方法依靠单分子荧光原位杂交（smFISH）或原位测序来可视化组织中的RNA转录物，可以检测多达10,000种不同的RNA种类，然而这种方式对大样本的分析非常耗时。

近日，瑞典卡罗林斯卡医学院研究团队在Nature biotechnology上发表了题为“Scalable in situ single-cell profiling by electrophoretic capture of mRNA using EEL FISH”的文章。研究人员开发了一种名为增强型电荧光原位杂交（EEL FISH）的方法，可在小鼠大脑的8个完整矢状切片中检测多达440个基因的表达模式。此外，研究人员将EEL应用于人类视觉皮层，结果发现EEL大大减少了限制smFISH检测人体组织RNA的高度自发荧光脂褐质沉积物。

文章发表于Nat Biotechnol

据文章介绍，EEL FISH是一种基于smFISH的方法，其将高复用与高分辨率大面积成像相结合。通过将RNA电泳转移到玻璃表面并去除组织，可以最大限度地减少成像耗时，同时还可以减少背景噪声、加速RNA标记并通过条形码促进多路复用。研究人员为每个颜色通道实现了多达448个基因的条形码，并实现了双色成像。

作为原理证明，研究人员针对440个基因和8个空条形码对照，经过图像处理和条形码解码后，EEL FISH检测到8,871,209个RNA分子，表明EEL FISH可以在整个组织切片、较小解剖结构和单细胞水平的尺度上分析空间表达模式（图1）。同时，与单独用oligo(dT)捕获相比，EEL FISH转移效率提高了60倍。与空间转录组学平台Visium by 10x Genomics相比，当只考虑Visium的捕获点时，EEL FISH捕获的重叠440基因的RNA是Visium的五倍，具有更高的空间分辨率。图1.EEL FISH方法和440基因小鼠数据集。来源：Nat Biotechnol

与被动扩散的RNA转移相比，EEL FISH减少了捕获RNA的横向分散，产生了更稳定的RNA印迹，保留了细胞分辨率。当使用EEL FISH时，反映小鼠大脑中细胞稀疏定位的RNA独特细胞模式也得到了更好的保存（图2）。

与osmFISH2相比，EEL FISH通过表面捕获RNA来加速成像，并通过减少由组织自发荧光和散射引起的背景噪声来提高信噪比（SNR），同时改进了显微镜的设置，将成像通量提高了40倍，图像采集时间减少到76s mm−2。osmFISH每个通道每轮只编码一个基因，EEL在16轮中每个通道编码多达448个基因，使通量再增加28倍。这些改进意味着EEL FISH可以在58小时内覆盖1cm2组织的完整448基因，比osmFISH快好几个数量级。图2.电泳提高了RNA印迹的准确性。来源：Nat Biotechnol

为了从EEL FISH数据生成单细胞表达谱，研究人员在组织解离之前以低放大倍率拍摄的碘化丙啶染色细胞核的图像用Cellpose进行分割，产生了一个由127,591个单细胞和440个基因组成的表达矩阵，共有5,369,992个转录本分配给细胞。

随后，研究人员利用标准的单细胞聚类方法构建了小鼠大脑中细胞类型的空间图谱，产生了代表主要细胞类型的187个细胞簇（图3），并在这些簇中发现了具有很少空间结构的丰富细胞类型，例如小胶质细胞和内皮细胞以及高度空间结构的神经元和神经胶质细胞，证明了EEL FISH可以从单个实验中揭示小鼠大脑的细胞类型组成。图3.EEL FISH数据的单细胞分析。来源：Nat Biotechnol

为了证明EEL FISH的稳健性和可扩展性，研究人员通过检测7个矢状切片中168个基因的表达模式，生成了小鼠大脑图谱，共检测到17,151,357个分子。（图4）研究观察到，各种结构的区域特异性基因表达在连续切片之间均显示出明显的对应关系。图4.七个矢状切面的小鼠脑图谱。来源：Nat Biotechnol

脂褐质的存在妨碍了使用osmFISH对人脑和其他人体组织的研究。研究人员发现EEL FISH消除了大部分脂褐素和组织自发荧光，使其能够用于研究人体样本。

研究人员在人类初级视觉皮层的0.75cm2样本切片上应用EEL检测了445个基因的表达（图5）。此外，为了探索人类视觉皮层的空间结构，研究人员构建了一个基于RNA分子邻域构建的无监督图神经网络，发现分子嵌入对应于空间和分子上不同的域，其中一些区域对应于人类皮层的已知细胞类型（图5）。以上结果表明，EEL FISH成功地应用于人类成人脑组织。图 5.成人视觉皮层的EEL FISH结果。来源：Nat Biotechnol

综上所述，EEL FISH基于显微镜和基于测序的空间转录组学方法建立，能够实现高复用、高空间通量和高分辨的RNA检测。该方法的主要优点是可以捕获和测序完整的转录组，而且比基于测序的方法成本低一个数量级，每次实验600美元（每个细胞约0.005美元）。此外，EEL FISH的优点是捕获表面是连续的，因此在捕获特征之间没有间隙。

随着空间转录组学的发展，该领域技术正扩展到大的组织区域并具有快速和强大的自动化分析能力，使得为特定研究问题生成定制的图谱成为可能。EEL FISH能够大规模研究复杂的组织样本，并有助于研究人脑的组织。