Nat Commun：单细胞空间代谢组学分析框架scSpaMet，可对同一组织进行空间分辨蛋白质和代谢物分析

代谢物和脂质在免疫反应和癌症中发挥着调节作用，通过对人体组织进行空间分辨代谢组学分析，可进一步研究健康和疾病中的化学平衡，了解免疫细胞和癌细胞相互作用的功能变化。

近年来，随着质谱成像（MSI）技术的不断发展，科研人员能利用其对大量蛋白质和代谢物进行空间分析。MSI方法提供了在空间背景下捕获代谢物信息的能力，但现有的MSI方法缺乏细胞类型标记，无法捕获组织中关键细胞特异性及相关性。因此，表征单细胞水平的代谢组学特征仍是一项艰巨的任务。

为解决上述难题，美国乔治亚理工学院和埃默里大学生物医学工程系的研究人员合作在Nature Communications发表了题为“Single-cell spatial metabolomics with cell-type specific protein profiling for tissue systems biology”的文章，提出了单细胞空间分辨代谢框架“scSpaMet”，通过将非靶向空间代谢组学和靶向多重蛋白质成像整合到单一管道中，在单细胞水平上分析人体组织中的免疫细胞和癌症细胞。

研究团队利用scSpaMet分别对人类肺癌、扁桃体和子宫内膜组织中19,507、31,156和8,215个单细胞进行分析，揭示了细胞类型依赖的代谢物谱和人类组织中邻近单细胞的局部代谢物竞争；细胞类型内独特的代谢物状态。该研究展示了scSpaMet对细胞类型特异性和空间分辨代谢蛋白质图谱进行定量和可视化的能力，有望成为系统理解组织生物学的新兴工具。

文章表发于Nature Communications

主要研究内容

多组学scSpaMet方法结合了3D-SMF18（一种实现亚微米分辨率代谢成像的框架）与多重IMC蛋白质组学成像，具有将蛋白质组学数据的多层信息与同一组织的代谢数据联系起来的巨大潜力（图1）。scSpaMet首先通过金属同位素偶联抗体对组织进行染色，使用飞行时间二次离子质谱（TOF-SIMS）成像进行代谢分析，然后使用IMC进行蛋白质组学分析；接下来，scSpaMet框架将连续ToF-SIMS和IMC数据集合并到单细胞水平，以整合信息并进行比较分析。

与现有的代谢组学分析方法相比，scSpaMet允许在单细胞水平上将多种细胞类型与代谢图谱相关联。与3D-SMF相比，scSpaMet结合了同一组织内代谢组和蛋白质组的原位顺序检测，并配备跨模态空间配准管道，提供了单细胞水平的相关蛋白质组、代谢组联合分析。此外，scSpaMet框架的精准单细胞分割允许人们进行单细胞水平代谢物和蛋白质的联合下游分析。

图1.scSpaMet框架在单细胞分辨率下整合综合代谢物和蛋白质分析

由于代谢组学数据具有非靶向发现性和低可变性，开发和确定合适的分析工具十分重要。目前，常用的单细胞数据整合分析的计算框架可实现：(i)同模态整合；(ii)具有共享特征的跨模态整合；(iii)同一细胞的跨模态多模态整合。

scSpaMet提供了三种额外的分析能力（图2）：①多组学细胞竞争分析，提取细胞类型、细胞代谢组学特征及其空间位置，比较局部邻近细胞代谢组学特征的变化，以推断单细胞水平上的局部代谢物竞争情况；②多模态数据整合，采用交叉模态变分自编码器（VAE）流程，将来自同一细胞的蛋白质组学和代谢组学特征进行整合；③多组学轨迹推断，使用细胞蛋白质组学数据在空间域中重建细胞分化轨迹，并与代谢组学特征进行相关分析，以提取沿细胞轨迹的化学途径。

图2.代谢组学和蛋白质组学模式与数据分析相结合

肺癌组织中细胞类型特异性代谢状态

癌症细胞可改变代谢程序，以满足其不断增长的能量需求，实现快速进展和侵袭性生长。这将导致肿瘤微环境（TME）缺乏关键营养物质，造成缺氧和酸性环境。因此，评估不同免疫细胞在应对不断生长的肿瘤时的不同代谢需求至关重要，能够发现新的代谢关系。

研究团队将scSpaMet应用于肺癌微阵列，以表征TME内蛋白质代谢环境，鉴定具有相似表达谱的蛋白质表型和细胞簇；从scSpaMet中获得以质荷比（M/z）为特征的质量通道，并将其与已知的注释进行关联，将相应的代谢物峰分为葡萄糖、胆固醇、氨基酸和脂质片段（图3）。结果显示，与葡萄糖途径相关的74 m/z甘氨酸、89 m/z乳酸和122 m/z腺嘌呤质量通道在肿瘤区域表达较高；与肿瘤区域相比，基质区域显示出更高的胆固醇表达水平；对于已确定的氨基酸和脂类相关通道，间质和肿瘤区域内的单细胞表达水平表现出高变异性。

图3.肺癌组织中肿瘤和基质区域之间的代谢物差异

细胞邻域代谢物竞争与血管距离的关系

在TME中，代谢重编程发生在肿瘤和非肿瘤组分中，即使在缺氧条件下，肿瘤细胞周围的代谢竞争也会为其提供稳定的营养物质供应。血管内皮细胞在血管系统中起着至关重要的作用，可促进或阻止肿瘤进展，以支持肿瘤代谢和代谢重编程。为研究血管化部位周围的营养输送对化学调节的影响，研究团队开发了一个用于肺部细胞TME中单细胞局部代谢物竞争分析的框架（图4）。

研究团队量化了邻近T细胞和肿瘤细胞的代谢物比率，并在组织的空间代谢组学图谱上重建了邻近细胞的代谢物竞争图。结果显示，48m/z蛋氨酸、42 m/z脂质、94m/z和45 m/z脂质片段的质量通道在距离CD31+内皮细胞较远的肿瘤细胞中表达较高；145.0 m/z谷氨酰胺、48.0 m/z和27.0 m/z的质量通道在接近CD31+内皮细胞的肿瘤细胞中表达较高。对于T细胞，148.0 m/z蛋氨酸、42.0、81.0和100.0 m/z脂质片段在CD31+细胞附近表达上调。此外，研究团队还分析了肿瘤和CD68+细胞与CD31+内皮细胞之间的局部代谢竞争并将其可视化。

图4.scSpaMet框架将癌症中的局部代谢物竞争量化为与内皮细胞距离的函数

scSpaMet在癌症患者肺组织、健康个体B细胞的空间代谢组分析

癌症不仅在细胞水平上是异质性的，在患者水平上也是异质性的。研究团队使用scSpaMet框架将患者水平代谢物分布分为高变化和低变化代谢物通道，并对其进行比较（图5）。结果显示，脂质片段在高变化通道和低变化通道之间分布；胆固醇片段通道在患者间差异很小；与糖代谢途径相关的通道在不同样本中差异较大。

图5.scSpaMet框架识别了癌症患者组织中蛋白质-代谢物的空间特征

扁桃体主要由B细胞和T细胞组成，与其他免疫细胞、上皮细胞协调工作，在免疫系统中发挥重要作用。研究团队将scSpaMet应用于健康人体扁桃体组织，以表征B细胞滤泡周围的蛋白质代谢环境（图6）。

scSpaMet鉴定了单细胞蛋白质表型，将分割细胞进行聚类。在每个患者组织图像中，来自无监督聚类的单细胞表型被分为滤泡区域、滤泡区域外、生发中心（GC）亮区（LZ）和GC暗区（DZ）。结果显示，GC区域内外的代谢物分布显示出显著差异。与GC外部相比，GC内部脂质片段表达上调，表明GC内外存在独特的代谢状态。

图6.扁桃体组织中B细胞滤泡周围的细胞类型特异性代谢状态

抗感染的体液免疫依赖于次级淋巴器官B细胞滤泡的GC分化过程。研究团队利用scSpaMet鉴定了GC内部相邻细胞间局部代谢物竞争的特征（图7）。结果显示，B细胞扁桃体GC被极化为LZ和DZ，在单细胞水平上具有功能和表型上的区别。

图7.ScSpaMet量化GC细胞类型特异性局部代谢物竞争

此外，scSpaMet可根据单细胞蛋白质表达和代谢物在空间分辨组织坐标中的相关性对B细胞轨迹进行分析；通过结合扁桃体GC内部单细胞蛋白质表型，scSpaMet能够推断出GC B细胞的伪时间轨迹（图8），确定了DZ到LZ和DZ到活化B细胞的两条明确的轨迹，并表征描述了沿定义的B细胞轨迹的代谢变化。

图8.scSpaMet推断GC内B细胞分化的代谢物轨迹

子宫内膜组织中的空间代谢组学分析

对不同细胞类型和不同条件下的代谢组学变化进行表征，能更好地剖析肥胖导致子宫内膜癌症的分子机制。研究团队使用scSpaMet对人类子宫内膜组织进行分析，表征了蛋白质代谢环境，分析了瘦弱和肥胖良性患者组织中不同区域的代谢变化（图9）。在肥胖良性样本中，葡萄糖途径相关通道（如74.0 m/z甘氨酸和89.0 m/z乳酸）表达较高，其他葡萄糖片段（71.0 m/z、87.9 m/z丙酮酸、99.0 m/z）在瘦弱良性患者中表达较高。

图9.scSpaMet表征人类子宫内膜样本中的蛋白质和代谢物

综上所述，研究团队开发了scSpaMet，这是一个用于单细胞水平的蛋白质-代谢物联合成像的框架，其允许对同一组织进行系统地单细胞分割、蛋白质数据表型分析和代谢物的空间亚微米级分析，能够对单细胞进行注释，并量化其代谢变化。scSpaMet还引入了代谢组学和蛋白质组学单细胞数据的附加分析功能。随着空间质谱成像分辨率、分子注释能力和效率的提高，scSpaMet为在组织环境中进行系统地单细胞代谢物和蛋白质分析铺平了道路。

论文原文：

Hu T, Allam M, Cai S, et al. Single-cell spatial metabolomics with cell-type specific protein profiling for tissue systems biology. Nat Commun. 2023;14(1):8260. Published 2023 Dec 13. doi:10.1038/s41467-023-43917-5